摘" 要：以46份中华樱桃种质为试材，进行ISSR引物扩增，根据扩增结果计算遗传距离并进行聚类分析。结果表明，筛选出12条多态性良好的ISSR引物，共获得106个条带，其中多态性条带78个，多态率为73.58%。46份材料间遗传相似系数为0.59 ～ 0.94，有效等位基因数、基因多样性、香农信息指数分别为1.36、0.21、0.32，说明山东地区中华樱桃遗传多样性较高。通过UPGMA方法进行聚类分析，12条ISSR引物能够完全区分46份种质，并将其分为7个类群。研究结果为山东地区樱桃种质资源的保存与利用提供参考。
关键词：中华樱桃；ISSR；种质资源；遗传多样性
中图分类号：S662.5""""" 文献标识号：A""""" 文章编号：1002－2910（2024）06－0036－06
ISSR analysis of Chinese cherry germplasm resources in Shandong Province
Abstract： In this study， 46 Chinese cherry （Prunus pseudocerasus Lindl.） germplasm were used as research materials， and DNA was extracted for ISSR primer amplification， and genetic distances were calculated based on the amplification results and analyzed by clustering. The results showed that 106 bands were obtained by PCR amplification with 12 selected ISSR primers， of which 78 bands were polymorphic， with a polymorphism rate of 73.58%. The genetic similarity coefficients among 46 materials were 0.59 ～ 0.94， and the effective allele number， gene diversity， and Shannons information index were 1.36， 0.21， and 0.32， respectively， which indicated that the genetic diversity of Chinese cherry was high in Shandong Province. Cluster analysis by UPGMA method showed that 12 ISSR primers were able to completely distinguish 46 germplasm and classify them into seven taxa. The conclusion showed that the genetic analysis of ISSR molecular markers can provide reference for the conservation and utilization of cherry germplasm resources in Shandong Province.
Keywords： chinese cherry; ISSR; germplasm resources; genetic diversity
中华樱桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）属于蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物，具有早果和自交亲和的特性，广泛应用于樱桃新品种选育[1]。山东泰安、枣庄、五莲等地区拥有丰富的中华樱桃地方种质资源[2，3]，但种质分类混乱，存在大量同名异物和同物异名的问题[4]，且部分种质正在或已经流失[5]，亟需加强对地方种质资源的收集、保护与利用。圃地保存是种质资源保存的常用方法，但需地面积大，工程量相对较大[6]。对于性状相近的种质，通过表型特征难以区分，需要从基因层面进行种质鉴定。目前ALFP[7]、RAPD[8]、RFLP[9]、SSR[10]等分子标记技术已经应用于欧洲甜樱桃的遗传多样性分析，能够从基因层面反映不同种质之间的差异。基于分子标记，对四川、贵州等地区的中华樱桃地方种质遗传资源进行了分析[11，12]。ISSR（Iinter-simple Sequence Repeat）标记是一种基于微卫星序列（SSR）的多态性分子标记技术，由加拿大特利尔大学的学者[13]提出。ISSR使用带有1～4个简并碱基的微卫星序列作为引物扩增重复序列之间的区域，不依赖已知物种的基因组序列，是一种理想的分子标记技术[14]，具有操作简单高效、技术难度低和成本低等优点，广泛应用于种质资源鉴定、进化与亲缘关系分析、遗传多样性评价等方面[15-18]。本研究通过ISSR分子标记对34份山东地区中华樱桃种质和12份省外种质进行遗传多样性分析，阐明种质资源之间的亲缘关系，为山东地区中华樱桃种质资源的分类、保存与利用、遗传转化等研究提供参考依据。
1" 材料与方法
1.1" 供试材料
46份中华樱桃种质资源信息见表1，其中34份山东地区种质、12份省外种质，样本编号前两位字母代表取样地（见表注）。选取无病虫害的幼嫩叶片，保鲜袋封存，液氮处理后，保存于－80 ℃冰箱。
1.2" DNA提取
采用北京博友顺生物技术有限公司的磁珠试剂盒提取叶片DNA，用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA质量及浓度，－20 ℃保存。
1.3" ISSR分析
ISSR反应体系和扩增条件。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的序列（Http：//www.
biotech.ubc.ca/services/naps/primers/Primers.pdf），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以随机抽取的4个样品基因组DNA为模板，利用梯度PCR扩增仪筛选引物及退火温度。PCR扩增体系（25 μL）为：DNA模板约40 ng，10×Bufer 2.5 μL，primer 0.3 μmol/L，四种dNTPs各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25U。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，然后进行35个循环：94 ℃变性45 s，55～62 ℃复性45 s，72 ℃延伸1.5 min；循环结束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.4" ISSR 扩增产物的检测
PCR产物在2.0 %的琼脂糖凝胶（电压120V电泳50 min）检测，以DL 2 000 Marker（天根生化科技北京有限公司）为标准分子量对照，紫外凝胶成像系统照相。
1.5" 数据统计分析
PCR扩增产物在凝胶的某个相同迁移率位置上有DNA条带记为1，无DNA条带记为0。对扩增产物的条带总数和多态性条带进行数量统计，计算多态性条带所占比例，形成ISSR的表型数据矩阵，通过NTSYS软件计算相似系数（DICE系数），并按照UPGMA法进行聚类分析，构建遗传热度图和聚类分析图。用POPGENE 32软件对供试材料的遗传多样性指数进行分析，计算观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei氏多样性（H）和香农信息指数（I）。
2" 结果与分析
2.1 "引物筛选及多态性分析
使用4个样本（QD1、TA5、ZZ1、ZZ8），在48条ISSR通用引物中筛选出12条多态性丰富、重复性好且扩增条带特征明显的引物进行批量实验（表2）。利用Popgene.32软件对46份樱桃资源的12条引物分别进行遗传多样性分析。
扩增结果表明，ISSR 标记数多，多态性丰富（图1），12条引物共扩增出长度为200～750 bp的条带106个，其中多态性标记 78个，多态率为73.58%。12条引物扩增的多态性条带在2～14条之间，平均每条引物扩增出6.5个标记，并且不同引物间存在较大差异。每个位点的平均有效等位基因数（Ne）为1.36，基因多样性（H）0.21，香农信息指数（I）0.32，因而上述引物可用于中华樱桃种质的鉴定。
2.2" 遗传相似系数分析
根据12条引物扩增产生的106份条带，计算46份樱桃种质间的遗传相似系数（DICE）。46份种质的遗传相似系数分布在0.59～0.94之间，平均遗传相似系数为0.78。其中LS-01崂山丰产（QD3）和丁家乔长把（QD4）2份种质的遗传相似系数最大，为0.94，表明2份种质的亲缘关系最近，可能为同物异名或者其亲本相似。成都C4（SC5）和LS-01崂山丰产（QD3）的遗传相似系数最小，为0.59，表明两者的亲缘关系较远。根据各个地区种质之间的平均遗传相似系数，山东泰安、五莲、崂山、枣庄地区平均遗传相似系数为0.81，其中泰安地区最高，为0.82，而枣庄地区最低，为0.79，表明山东不同地区种质之间亲缘关系较近，种质资源多样性较差。来自江苏的东塘樱桃（JS1）[19]和其他45份种质的平均遗传相似系数最低，为0.67，遗传距离最远。
2.3" ISSR聚类分析
根据“0”“1”矩阵数据，利用NTSYS软件分别计算46份种质遗传相似矩阵，构建遗传距离矩阵热图（图2）。根据GS值矩阵，利用UPGMA法对46份种质的ISSR结果进行聚类分析，得到环状聚类图（图3）。
根据UPGMA聚类分析图，46份中华樱桃可以分为7个类群以及山亭超早红（ZZ6），乌皮樱桃（CQ1）2份游离种质。其中第I类群包括尖嘴黄樱（ZZ10）、MYRX（LY2）、丁家乔长把（QD4）、
LS-01崂山丰产（QD3）、成都红花（SC4）、东塘樱桃（JS1）共6份种质；第II类群包括成都C4（SC5）、五莲水樱桃（RZ5）、安丘大硬（WF2）、五莲大红（RZ1）、五莲尖黄（RZ2）、山亭尖嘴黄樱1（ZZ8）、山亭尖嘴黄樱2（ZZ9）、五莲硬肉1（RZ6）共8份种质；第III类群包括天宝红樱（TA1）、蒙阴红樱（LY1）、沂源尖嘴（ZB1）、龙廷尖黄院内（TA4）、崂山黄樱（QD1）、丁家乔短把（QD5）、襄星（SC6）、泰山红樱1（TA5）共8份种质；第IV类群包括4份泰安地区的种质（泰山干樱、泰山红樱2、天宝黄樱、龙廷尖黄山上）以及崂山红樱（QD2）共5份种质；第V类群包括五莲短枝红（RZ4）、五莲早红（RZ3）、越星（ZJ2）、安丘尖嘴（WF1）、山亭桃源黄樱（ZZ5）共5份种质；第VI类群包括大果脆（SC1）、成都贾家土樱桃1（SC2）、成都贾家土樱桃2（SC3）、浦江小樱桃（ZJ1）、玛瑙红（GZ1）共5份种质，第VII类群包括来自枣庄的5份种质（山亭小白花、山亭小尖叶、滕县大红樱桃、山亭大尖叶、山亭大窝娄叶）以及来自湖北的房县小樱桃1（HB1）和房县小樱桃2（HB2），共7份种质。
3" 小结与讨论
3.1" 山东樱桃种质资源的多样性
通过各地区樱桃种质的聚类分布和遗传相似系数来看，泰安地区的种质遗传多样性不高，在聚类分析图上单独聚类（第III和第IV类群），这与泰安地区平均遗传相似系数最高的结论一致。枣庄地区的遗传多样性最为丰富，聚类在I、II、V、VII类群中，其中还包括一份难以聚类的种质ZZ6（山亭超早红）。前期调查发现，枣庄地区拥有丰富的本地特色资源[20]，并进行过人工选种和对外引种工作[21]。这似乎可以解释为何枣庄和湖北房县的种质亲缘关系较近。五莲和崂山地区的种质尽管地域接近，但是互相之间遗传距离较远，分散在I～V五个类群中，表明五莲和崂山地区的中华樱桃种质遗传多样性相对丰富，这与之前种质资源调查的结论一致[22]。Itow的观点认为，在气候湿润地区，海拔高度的增加会提高物种多样性[23]，这可能是崂山和五莲地区樱桃种质遗传资源丰富的原因之一。此外，过去的调查表明崂山地区曾经大量引入日本的樱亚属植物[24]，这进一步提高了崂山地区种质的遗传多样性。综合来看，山东省内中华樱桃种质资源较为丰富，应当加强对地方特色种质的保护，依托特色种质选育优良品种。
3.2" 遗传距离与地理距离的相关性
46份材料在遗传相似度和地理距离上相关性不强，聚类分析中不同地区的种质可以被划分为同一类群。比如第I和第II类群与其他5个类群均有一定遗传距离，这两个类群内包括数份来源地不同的种质，但是彼此之间有一定相似性状，如来自第I类群的尖嘴黄樱（ZZ10）和MYRX大山河村硬肉（LY2）都具有黄色果皮、尖嘴、心脏形果实的特征，可能代表2个类群内种质的来源比较接近或者具有相似的亲本。同时也出现来源地相同的品种未能聚类在一起的情况。如两份龙廷尖黄种质（TA3和TA4）就被划分为不同的类群，其中TA3和崂山红樱（QD2）亲缘关系较近，而TA4和崂山黄樱（QD1）更为亲近，这种现象可能是区内引种导致外地种和本地种之间发生基因渗入[25]，也可能是分子标记更能反映基因组本质差异[26]。
曹东伟认为，山东是第四纪冰期樱亚属植物向低纬度迁移时的避难所之一[27]，因此山东地区拥有较为集中的中华樱桃野生群体分布。考虑到山东地区山脉成片分布，野生樱桃群体能够沿泰山—沂蒙山山脉扩展，并发生群落间基因交流，同时大量的区内引种降低了地理距离对于基因交流的阻碍，使得山东地区的种质具有较高的遗传相似度。
3.3" ISSR遗传标记对种质资源鉴定和保存的意义
中华樱桃野生资源较多，许多野生资源形态相似，仅靠形态特征难以区分，同时在前期调查中发现部分地方种质由于尚未审定，仅使用地方名，造成大量同物异名和同名异物的现象[28]，这进一步加大了鉴别的难度。分子标记可以反映种质的遗传本质，因此可以借助分子标记来研究不同种质的基因组差异，提高种质鉴定效率，降低重复保存。本研究筛选出12条引物，通过排列组合能够区分全部46份种质资源。同时研究表明，通过增加ISSR引物的数量，能够鉴别更多材料[29，30]。ISSR分子标记不需要预知物种的基因组信息，具有DNA 样品用量少、信息量丰富、重复性好、操作简单等特点[31]，可以作为鉴别种质资源、分析种群遗传进化的高效手段，广泛应用于大规模种质资源鉴别工作。汪祖华认为，经过人工选育的中华樱桃相较于野生型表现出更大的遗传差距和更远的亲缘关系[32]。本研究中难以聚类的两份种质均为人工选育品种，其中乌皮樱桃（CQ1）为省外优系[33]，山亭超早红（ZZ6）是2007年枣庄市选育并审定的中华樱桃品种，已经引种到省外多个地区[21]，这说明通过分子标记进行聚类分析，可以区别外地种和本地种，人工选育种和野生种。未来通过分子标记结合形态学调查，可以进一步发掘中华樱桃的群居遗传特征，筛选具有地方代表性的种质，发掘具有潜力的育种材料，为种质资源利用及品种改良等提供科学依据。
参考文献：
马蓝，陈隆隆，马艳，等．50份中国樱桃品种资源的果实质地品质评价［J］．江苏农业学报，2023，39（7）：1613－1616．
刘焕芳，陈学森，段成国，等．甜樱桃与中国樱桃杂种的胚抢救及杂种鉴定［J］．园艺学报，2004，31（3）：303－308．
成陈涛，李良，张静，等．中国樱桃种质资源的考察、收集和评价［J］．果树学报，2016，33（8）：917－933．
过晓姣，王小蓉，陈涛，等．中国樱桃遗传资源多样性研究进展［J］ ．果树学报，2013，30（3）：470－479．
史传铎，于希志，李伯真，等．山东樱桃良种简介（一）——中国樱桃［J］．落叶果树，1982（4）：34－35．
LI M M， CAI Y L， QIAN Z Q．Genetic diversity and differentiation in Chinese sour cherry Prunus pseudocerasus Lindl．，and its implications for conservation［J］．Genetic Resources and Crop Evolution，2009，56（4）：455－464．
陈新，徐丽，宗晓娟，等．应用FISH-AFLP技术分析105份樱桃种质资源的亲缘关系［J］．山东农业科学，2019，51（11）：22－27．
陈晓流，陈学森，束怀瑞，等．15个樱桃品种的RAPD分析［J］．果树学报，2004，21（6）：556－559．
曹东伟，蔡宇良，杨娟，等．中国樱桃的PCR-RFLP分析［J］．西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（5）：173－178．
艾呈祥，辛力，张力思，等．用微卫星标记研究樱桃品种间的亲缘关系［J］．果树学报，2007，24（4）：460－465．
宋常美，文晓鹏，杨尔泰，等．贵州樱桃种质资源的ISSR分析［J］ ．园艺学报，2011，38（8）：1531－1538．
陈娇，王小蓉，汤浩茹，等．基于SSR标记的四川野生中国樱桃遗传多样性和居群遗传结构分析［J］．园艺学报，2013，40（2）：333－340．
Zietkiewicz E， Rafalski A，Labuda D． Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification［J］． Genomics，1994，20（2）：176－183．
Morgante M， Olivieri A M．PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics［J］．Plant Journal，1993，3（1）：175－182．
余贤美，艾呈祥．杧果野生居群遗传多样性ISSR分析［J］．果树学报，2007，24 （3）：334－338．
武志江，黄凤珠，黄黎芳，等．基于ISSR标记的火龙果种质资源遗传多样性分析［J］．热带作物学报，2021，42（1）：47－53．
李国田，艾呈祥，张力思，等．核桃实生居群遗传多样性ISSR分析［J］．植物遗传资源学报，2011，12（4）：640－645．
高天翔，蔡宇良，冯瑛，等．中国樱桃14个自然居群遗传多样性和遗传结构的SSR评价［J］．园艺学报，2016，43（6）：1148－1156．
杨军，孙怡．中国樱桃品种经济性状的综合评判［J］．生物数学学报，1998，13（3）：334－337．
［20］ 赵元伦．枣庄樱桃地方特色品种［J］．中国果业信息，2011，28（5）：54．
张丽娟，段春玲，王芬，等．樱桃新品种超早红的选育［J］．山东林业科技，2014，44（3）：41－44．
李玉生，程和禾，陈龙，等．中国樱桃与甜樱桃种质资源在我国的分布［J］．河北果树，2019（2）：3－7．
ITOW S． Species turnover and diversity patterns along an elevation broad-leaved forest coenocline［J］．Journal of Vegetion Science，1991（2）：477－484．
王瑾，黄栋，李冬林，等．青岛崂山樱亚属植物的分布种类及资源利用研究［J］．江苏林业科技，2004，31（3）：19－21．
张淑青，刘冬成，刘威生，等．普通杏品种SSR遗传多样性分析［J］．园艺学报，2010，37（1）：23－30．
王志峰，孙日飞，孙小镭，等．山东省黄瓜地方品种资源亲缘关系的AFLP分析［J］．园艺学报，2004，31（1）：103－105．
曹东伟．李属樱亚属植物分子亲缘地理学研究［D］．西安：西北大学，2006．
黄晓姣，陈涛，梁勤彪，等．14份中国樱桃种质经济性状的初步评价［J］．中国南方果树，2011，40（5）：9－12．
陈晓流，陈学森，束怀瑞，等．15个樱桃品种的RAPD分析［J］．果树学报，2004，21（6）：556－559．
蔡宇良．野生樱桃种质资源的遗传分析及其栽培品种的DNA指纹鉴定［D］．西安：西北大学，2006．
王惠梅．基于SSR和ISSR的鄱阳湖流域野生菰资源的遗传多样性分析［J］．植物遗传资源学报，2015，16（1）：133－141．
汪祖华，周建涛．樱桃品种的花粉形态观察［J］．落叶果树，1989（1）：1－3．
洪莉，张加正，江景勇，等．中国樱桃黑珍珠优质丰产栽培技术［J］．现代农业科技，2009（19）：126．
