摘 要：【目的】研究海棠（Malus spp.）上病毒病的种类及田间侵染情况。
【方法】利用宏病毒组测序技术结合RT-PCR方法，对采自新疆7个海棠种植区的158份样品进行病毒检测。
【结果】宏病毒组测序结果只对比到苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）一种植物病毒。158份海棠样品中巴音郭楞蒙古自治州（简称巴州）、阿克苏地区、喀什地区、昌吉回族自治州（简称昌吉州）、石河子市、伊犁哈萨克自治州（简称伊犁州）、奎屯市ASPV检出率分别为0.00%、12.00%、0.00%、31.71%、29.41%、17.65%和0.00%。在检测的7个种植区中，昌吉州检出率最高，为31.71%；石河子市检出率次之，为29.41%；巴州、喀什地区和奎屯市未检测到ASPV。
【结论】海棠上的ASPV在北疆检出率较高，在南疆检出率较低。在观赏海棠样品中检测到ASPV，其病毒检出样本均为田间发病症状叶片，与田间观察到的发病情况相符合，海棠为ASPV的自然寄主之一。
关键词：海棠；宏病毒组测序；苹果茎痘病毒；RT-PCR；病毒检测
中图分类号：S436 ""文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）12-3061-06
0 引 言
【研究意义】海棠是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus Mill.）中果径小于5 cm的落叶乔木或小乔木的统称，树形优美，花色花形缤纷多彩，叶色叶形多种多样，尤其特别的是还有一些冬季观果品种，是极具观赏价值的园林绿化树种［1-3］。海棠是我国本土花木，栽培历史悠久，在园林中广泛运用。除了观赏价值以外，海棠果实还具有食用价值和药用价值，由于其口味酸甜清脆，可生食、做蜜饯、做果酱、做果醋、做果酒以及做果丹皮等，具有较高的食用价值；海棠果实及提取物还具有一定的药用价值［4-6］。【前人研究进展】苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus， ASPV）是果树病毒病中很重要的一种病毒，在苹果和梨上普遍发生，广泛分布。除了苹果和梨，ASPV在花楸［7］（Sorbus pohuashanensis）、榅桲［8］（Cydonia oblonga）、樱桃［9］（Prunus avium）、枇杷［10］（Eriobotrya japonica）、山楂［11］（Crataegus pinnalifida）等果树中也有报道。ASPV于1954年首次在欧洲野苹果上报道［12］，侵染果树后症状一般不明显，但造成果树生长不良，树势衰退，导致果品和产量下降［13］。早期研究者认为梨树上的梨栓痘病（Pearcorky pit）、梨脉黄病（Pear vein yellow）、梨黄化病（Pear yellow）和梨坏死斑点病（Pear necrotic spot）等病害是由不同病毒引起的，经研究发现以上几种病害均是ASPV引起的［14］。ASPV是凹陷病毒属Foveavirus的代表种［15］，其基因组为正义单链RNA，约9 306 nt，编码5个开放阅读框（open reading frame， ORF）［14］。该病毒指示植物有斯派227（Spy227）、杂种榅桲（Pyronia veitchii）、光辉（R65-76 Radiant）等木本植物和西方烟37B（Nicotiana occidentalis）、西方烟亚种（Nicotiana occidentalis subspobligua）、千日红（Gomphrena globosa）等草本植物［16-18］。【本研究切入点】目前国内外对海棠病毒病的研究较少，需鉴定新疆海棠上苹果茎痘病毒。【拟解决的关键问题】在新疆7个地州采集了海棠叶片样品，并对其进行检测。将采集的样品混样通过宏病毒组测序和RT-PCR技术，明确其在海棠上的发生情况，为海棠病毒病进一步研究和精准防控提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 海棠疑似感病叶片
2022～2023年从新疆巴州、阿克苏地区、喀什地区、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市采集了158份海棠疑似感病叶片样品，症状为叶片黄化泛白、叶尖叶缘坏死、叶片畸形反卷。昌吉州、石河子市和伊犁州疑似感病症状较多，巴州、阿克苏地区和奎屯市有少许疑似感病症状，喀什地区几乎没有疑似感病症状。无疑似感病样品较多的种植区采集健康叶片样品。所有样本经蒸馏水清洗后放入自封袋，经液氮速冻后，用液氮罐带回实验室，保存到-80℃超低温冰箱备用。图1
1.1.2 所用仪器
DW-86L338J超低温冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）；BCM-1000A超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；OSE-VX-01旋涡混合器，（天根生化科技（北京）有限公司）；TGL-16高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HH.S-21-8电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；BIO-RAD T100 PCR仪（美国伯乐中国上海分公司）；keebio-600N电泳仪（上海嘉鹏科技有限公司）；KCBIO2008凝胶成像系统（北京原平皓生物技术有限公司）；BSD-TX270台式智能精密摇床（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；BSP-150生化培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；移液枪。图1
1.2 方 法
1.2.1 宏病毒组测序
将采集于巴州、阿克苏地区、喀什地区、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市7个地州市的海棠疑似病毒病叶片样品混和，送至诺禾生物科技有限公司进行宏病毒组测序。
1.2.2 总RNA的提取和RT-PCR反应
先用液氮预冷研钵，后将采集的样本置于盛有液氮的研钵中研成粉末，使用FOREGENE公司的Plant Total RNA Isolation Kit Plus试剂盒提取样本的总RNA，后使用琼脂糖凝胶电泳和Nanadrop分光光度计检测样品RNA完整性和纯度。使用北京全式金生物技术有限公司生产的EasyScript One- Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将总RNA进行反转录，反应所得cDNA放-80℃冰箱保存或直接用于下游实验。
PCR反应体系为2×Es Taq Mastermix（Dye）（北京康为生物科技有限公司）12.5 μL，上下游引物10 μmol/L各1 μL，模板cDNA为1 μL，灭菌ddH2O补足至25 μL；PCR反应程序 ：预变性94℃，2 min；变性94℃，30 s；退火53℃，30 s；延伸72℃，30 s；35个循环；终延伸72℃，10 min；保存4℃，∞。
1.2.3 检测引物及可靠性验证
病毒检测引物ASPV-F（5-ATGTCTGGAACCTCATGCTGCTGCAA-3）和ASPV-R（5-TTGGGATCAACTTTACTAAAAAGCATAA-3）参考已报道引物序列［19］，预测产物片段大小为370 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。用1.5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，并在KCBIO2008凝胶成像仪下观察并拍照记录检测结果，利用北京全式金生物技术有限公司生产的PCR产物纯化回收试剂盒回收产物，将回收得到的目标片段连接到pUCm-T载体上，后热击转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞（生工生物工程（上海）有限公司），经菌落PCR鉴定后，将得到的阳性克隆随机挑选3个送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。
1.3 数据处理
对158个采集样本提取的总cDNA进行PCR扩增，反应体系同1.2.2，得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，与预测产物片段大小做对比，并计算检出率：
检出率（%）=检出样品数/样品总数×100。
2 结果与分析
2.1 宏病毒组测序
研究表明，7个地州市采集的海棠样品混样进行宏病毒组测序，将获得的contigs过滤掉宿主基因组序列后与NCBI数据库进行比对，只匹配到一种植物病毒，即苹果茎痘病毒，其相关序列2条contigs。在对宏病毒组测序结果中一些较短且未分类的contigs序列对比时，发现有2条contigs也能对比到ASPV。
2.2 检测引物及可靠性验证
研究表明，以疑似感病海棠叶片RNA反转录得到的cDNA为模板，使用特异性引物（ASPV-F）＼＼（ASPV-R）进行PCR扩增，得到与ASPV大小相近的目的条带，将胶回收目的基因片段克隆、阳性鉴定、测序。测序得到的目的基因序列经NCBI数据库对比与ASPV的同源性为100%，与宏病毒组测序结果一致，宏病毒组测序结果和检测引物具有可靠性。图2，图3
2.3 田间检测结果
研究表明，共有27份样品检测到了ASPV，检出率为17.09%。其中昌吉州的ASPV检出率最高，为31.71%；石河子市次之，检出率为29.41%；伊犁州检出率为17.65%；阿克苏地区检出率为12.00%；库尔勒地区、喀什地区、奎屯市三地均未有检出。北疆种植区检出率明显高于南疆种植区检出率。图4，表1
3 讨 论
3.1
ASPV可侵染多种果树，是果树病毒病重要病原之一［7-11］。研究利用宏病毒组测序和RT-PCR检测技术，明确海棠是ASPV自然寄主之一。海棠上的病毒病系统的研究较少，除了研究检测到的ASPV，曹晓凤［20］在八棱海棠种子中利用RT-PCR方法检测到了苹果茎沟病毒（Apple Stem Grooving Virus， ASGV），并明确八棱海棠可以通过种子传播ASGV。郭超等［21］运用RT-PCR技术在八棱海棠果皮、果肉、种子以及种胚中均检测到了苹果锈果类病毒（ Apple skin scar viroid， ASSVd），并明确该病毒在八棱海棠中可以通过种子传播。张富军等［22］利用RT-PCR方法在有“花脸”症状的火焰海棠的果皮上也检测到了ASSVd。
3.2
研究调查了ASPV在新疆库尔勒市、阿克苏地区、喀什地区、昌吉州、石河子市、伊犁州、奎屯市7个地区的发生分布情况，检测结果显示，158份样品中有27份呈ASPV阳性，检出率为17.09%，检出ASPV的样品多数为有疑似病毒病症状的样品，虽然有报道称ASPV为潜隐性病毒，侵染多数栽培品种后并不引起明显症状［13］。但也有研究指出感染ASPV的树体也可能出现明显症状，如梨上的梨脉黄病、梨黄化病等［14］，在弗吉尼亚小苹果（Malus pumila cv.virginia crab）和Spy227上分别表现出木质部上产生茎痘斑，以及叶片畸形和树势衰退的症状［23］，研究通过宏病毒组测序只检测出ASPV一种植物病毒，但也不能完全确定ASPV和海棠叶片疑似病毒病症状的相关性，对于两者之间的联系仍有待进一步研究验证。
4 结 论
对采自新疆7个地州的158份海棠叶片进行RT-PCR检测，共检出27份样品，检出率为17.09%，海棠上的ASPV在北疆地区检出率较高，在南疆地区检出率较低。
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Occurrence and detection of begonia infected by apple stem pitting virus
ZHANG Liya1， LIU Baojun1， SHAN Jiaqi1， WANG Shu1， GU Aixing1， BAI Jianyu2
（1. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Research Institute of Economic Forestry， Xinjiang Academy of Forestry Sciences， Urumqi 830063， China）
Abstract：【Objective】 To identify the species and field infection of viral diseases on ornamental Malus spp.
【Methods】 ""A total of 158 samples from 7 areas of Xinjiang were detected by macro virus sequencing technique combined with RT-PCR.
【Results】 Only one plant virus was compared with apple stem pitting virus （ASPV）.Among 158 samples of ornamental begonia， the ASPV detection rates were 0.00%， 12.00%， 0.00%， 31.71%， 29.41%， 17.65% and 0.00% in Bayingoleng Mongolian Autonomous Prefecture， Aksu Region， Kashgar Region， Changji Hui Autonomous Prefecture， Shihezi City， Yili Kazak Autonomous Prefecture and Kuitun City， respectively.Among the 7 areas tested， Changji had the highest detection rate （31.71%）.The detection rate of Shihezi City was 29.41%.ASPV was not detected in Kashgar Prefecture and Kuitun City.
【Conclusion】" The results showed that the detection rate of ASPV on ornamental begonia is higher in northern Xinjiang and lower in southern Xinjiang.ASPV is detected in ornamental begonia samples， and the virus detected samples were all symptomatic leaves in the field， which was consistent with the disease observed in the field.Ornamental begonia is one of the natural hosts of ASPV.
Key words：ornamental begonia; macro virus sequencing; apple stem pitting virus; RT-PCR; virus detection
Fund projects：The Forestry Science and Technology Special Project of the National Forestry and Grassland Administration \"Census of Alien Invasive Plant Pathogenic Microorganisms in Xinjiang Forest， Grassland and Wetland Ecosystem\" （65000022P00789110010X）
Correspondence author：GU Aixing（1973-），female，from Xinjiang，professor，Ph.D.， master and doctorals supervisor，research direction：cotton disease resistant breeding，（E-mail）gax@xjau.edu.cn
BAI Jiunyu（1977-），male，from Hebei，researcher，research direction：monitoring，early warning and prevention of forestry pests，（E-mail）bjyhao2010@sina.com
基金项目：国家林业和草原局林业科技专项“新疆森林、草原、湿地生态系统外来入侵植物病原微生物普查”项目（65000022P00789110010X）
作者简介：张李娅（ 1999- ），女，云南人，硕士研究生，研究方向为植物病理学，（E-mail）2768296845@qq.com
通讯作者：顾爱星（ 1973- ），女，新疆人，教授，博士，硕士生/博士生导师，研究方向为棉花抗病育种，（E-mail）gax@xjau.edu.cn
白剑宇（ 1977- ），男，河北人，研究员，研究方向为林业有害生物监测预警与防控，（E-mail）bjyhao2010@sina.com
