牛人工输精技术已在畜牧业中得到广泛应用。该技术的优势显着，能够迅速冷冻适宜配种的种牛精液，有效降低疾病传播风险，极大地提高优良种牛的利用率。同时，它还能为牛场解决在繁育过程中饲养种牛所带来的诸多不便，降低相关费用。尽管母牛人工输精技术已为众多畜牧工作者所熟知并应用，但在实际操作过程中，仍存在不少细节问题。具体表现为操作存在随意性和不规范性。许多技术人员在进行人工授精操作时，未能严格依照规定标准执行。比如，人工授精设备较为简陋；输精前，未充分做好严格的卫生消毒工作；精液解冻存在问题，要么解冻不完全，要么解冻时间过长，且精液在户外暴露时间过久。上述这些不符合规范的操作流程，严重影响了配种受胎率。为了切实提升牛人工输精的效果，保障畜牧业的健康发展，针对上述问题，必须采取一系列行之有效的改进措施。
一、母牛人工输精前母牛发情鉴定
1、母牛发情鉴定的前期准备
当饲养者观察到母牛出现发情迹象，如阴部发红、持续鸣叫、试图爬跨其助手牛只或被其助手牛只爬跨时，应立即通知配种员。通常情况下，母牛会在上午表现出发情行为，在下午进行交配；若在下午发情，则应在第二天早晨进行配种。然而，大多数母牛倾向于在夜间发情，因此配种员会综合考虑母牛的行为表现、年龄及胎次，以决定是否进行配种。
配种员在进行配种工作前，必须穿着整洁的制服和皮靴，并确保指甲剪短、磨平。彻底清洁并消毒双手，或者使用免洗消毒液进行手部清洁，确保干燥。佩戴一次性塑胶手套。
2、母牛发情鉴定的外部观察
配种员用肉眼将母牛的阴门打开，结合外阴颜色，阴道黏膜和黏液状况来判定是否发情。一般来说，在发情期的最后阶段交配，成功率较高。这个时候，母牛平静，食欲恢复正常，躲开了其他牛爬跨；外阴肿胀不显着，横纹逐渐恢复；阴道黏膜充血、变淡、变暗；阴道内有少量的黏液，颜色浑浊，不透明。
3、母牛发情鉴定的直肠检查
对于卵泡囊肿、子宫炎症，或妊娠期不超过2个月的母牛时，可能会表现出发情的迹象。因此，进行直肠检查是必要的，以避免误配。
配种员在遵循个人工作习惯的同时，应彻底清洗、消毒并干燥双手，随后佩戴一次性或长臂式塑胶手套，并在手套外均匀涂抹润滑油。
母牛在检查过程中通常会向两侧蹬腿。因此，配种员应站在母牛后方，双腿分开，膝盖向前弯曲，以便在紧急情况下迅速后退，确保自身安全。
配种员将母牛尾巴拉向一侧，轻触阴门后移至肛门处。母牛放松后，手指插入直肠检查。若直肠内有宿便，先清除。检查时触摸子宫颈口，检查子宫体、子宫颈、输卵管及卵巢。发情晚期，卵泡可增至约2.0cm，突出于卵巢表面，壁薄膨胀，触摸有起伏感，易于破裂，此时人工授精成功率高。直肠检查可发现卵泡壁薄、张力高、波动明显的囊泡，建议每隔2～3d复查。确认母牛发情后，应立即人工授精。
二、母牛人工输精的操作方法
1、不同类型冻精解冻操作方法
（1）颗粒冻精解冻操作方法
①解冻液的配制方法有3种可供选择：第1种，将2.9g柠檬酸钠溶解于100mL的双蒸馏水中；第2种，混合3g葡萄糖和1.4g柠檬酸钠，并加入100mL双蒸馏水。制备这两种成分的溶液后，需经过3次过滤，并通过高压蒸汽或沸腾灭菌3h。随后每100mL溶液中加入5000～10000单位的青链霉素。将处理好的溶液分装至玻璃瓶中，存放在4℃的冰箱或阴凉处备用；第3种，使用鲜牛奶。首先，用四层纱布过滤鲜牛奶，然后将其倒入消毒过的烧杯中，并通过隔水煮沸3次。每次煮沸后待冷却并去除奶皮。在每100mL冷却后的牛奶中加入100万单位的青霉素，并与配制的溶液同时使用，以防止变质。
②解冻方法：采用35～40℃的高温热水浴法以实现快速解冻。首先，对试管进行消毒和清洗，然后加入1～1.5mL的解冻液。将试管放入已加热至35～40℃的水浴杯（壶）中。待水温稳定后，使用预先冷却的长柄镊子迅速取出1～2颗冷冻精液，投入试管中，并轻轻摇动。当冷冻精液溶解至1/2或1/3时，立即从水中取出试管，并继续轻摇直至完全溶解。之后进行镜检，确认无误后即可使用。为避免2次冷冻对精液活力造成损害，请注意防止冷击。
（2）细管冻精解冻操作方法
使用预先冷却的长柄钳从容器中取出细管冻精，随后立即将其置于38±2℃的温水中进行直接浸泡和解冻。大约10～15s后，取出细管冻精，用无菌纱布轻轻擦拭其表面水分。接着，使用专用的消毒剪刀剪去超声波热合封口端，进行镜检，以备后续使用。
2、冻精质量的镜检操作
冻精需经历采集、贮存、运输、配送和解冻等环节，品质不易保证。常规检测仅需少量样本。解冻后，精液应在38～40℃的显微培养箱中进行活力检测。精子存活率的精确评估需要定期使用血细胞计算器。检测方法包括用生理盐水稀释后计算死精子数量，再稀释杀死所有精子后计算总数，两者的差值即为活精子数。精子活率需大于0.30，向前运动精子数需超过1000万才能输精。输精器的灭菌效果需通过显微镜检查确认，解冻后活度无变化方可输精。输精后，还需检查输精器中剩余精液，若精液已死，则需重新输精。
3、母牛人工输精的最佳时机及输精方法
母牛的排卵通常发生在发情周期的最后三个阶段，即在发情结束后的1～1.5d内。在大多数情况下，发情结束后的8～12h内进行人工授精是最为适宜的。因此，在使用冻精进行配种时，最佳时机是在排卵期即将来临时。另外，观察母牛阴道黏液的情况，理想的操作时间是在黏液量增多且变得浑浊的时期。
（1）母牛人工授精最佳时间
①发情期内一次授精
在母牛不再表现出发情迹象后的12h内，尤其是3～5h内进行授精，可获得最高授精成功率。年轻或营养良好的母牛，发情后即可授精。发情期内两次授精，首次在母牛发情后8～12h进行，第2次在8～12h后。例如，若母牛早晨发情，首次授精在早晨，第2次在次日早晨，随后在次日下午再次授精。使用直触法时，选择壁薄、体积大、弹性好且波动明显的卵泡，在排卵前授精。若8～12h内卵泡未破裂，可再次授精直至排卵。新发现或刚排出的卵泡也可再次授精，正常情况下受孕概率约3%。
②母牛人工输精方法
首先要把发情母牛圈在繁殖架上，不能有任何限制的就把牛拴在牛栏或树墩上。配种员先检查阴道是否有炎症性分泌物，如果发现有疾病，就停止输精，并做好记录，留待日后进一步治疗。配种员用一副一次性的塑胶长臂手套，在其外部喷洒一些润滑剂。例如肥皂，石蜡等，然后侧着身子站在牛的背部，首先用手触摸肛门，然后将手指握成锥形，然后慢慢转动，将里面的粪便排出。在这个过程中，配种员用一次性的吸水巾将阴部清洗干净，或者是用75%的酒精来进行消毒，同时，助手开始对精子的解冻和装枪，当助手把枪装好之后，站在牛的身体的一侧，用大拇指和食指分别捏住阴唇，往上一提，让配种员能更好地看见阴道口。配种员用右手拿着引精器，以30°的水平面从阴唇插入阴道，在接触到阴道上壁后，以水平角度轻轻、缓慢地插入阴道，避开尿道口，然后左手探入直肠，沿着前下缘轻轻触碰，寻找宫颈，握住宫颈阴道端（小心不能用力过猛，导致宫颈游离下垂，使得引精器难以插入），此时，双手同时用力，右手把输精器的顶端推到左手按压的位置，双手同时用力摆动，防止输精器滞留阴道穹窿，输精器的前端伸进宫颈口，有时阴道壁会阻碍输精器的插入，可以用后移输精器或将子宫前移后慢慢插入，左手不断前进，改变宫颈方向，输精器穿过褶壁轮，枪头插入宫颈深处5～8 cm处，但不能盲目插入过深，否则会把子宫内膜刺破，引起子宫出血，通常要达到有卵泡的子宫角基部或深层。此时，可由第一位助手用右手慢慢地将输精器中的精液排出，然后慢慢地退出输精器。如排精困难，可将引精器往后移一点，然后注射精液。如果输精枪内仍有较多的精液，应再次输精。拔精后，取精时，用左手在直肠中稍作停顿，按摩宫颈，可预防精液回流。如果母牛宫颈很难插进去，可以先用消毒过的扩宫棒将其扩张，再输精。切勿让一头母牛久待，如果15min以上仍很难插入，则应该放弃，否则会对母牛的子宫造成伤害。
在牛场选择有责任心、有经验的配种员，实行控冻精的输精，不能频繁更换配种员，要按照操作规范，做好配种记录，避免近交。同时肌肉注射曲普瑞林 25g能明显地提高母牛的受胎率。如果农户居住的地方比较分散，配种员应该准备一个小液氮罐，把性控精液装入液氮罐中，然后带到农户现场解冻，这样可以防止性控精液解冻后在室外停留太久，导致精子活力降低。
三、牛人工授精操作中注意事项
1、人工授精站的设置
配种站（点）应选址于母牛分布密集、便于集中管理且交通便捷的区域。操作间需朝向阳光且保持干燥，精液处理室应确保窗户明亮、台面洁净，并配备顶棚，地面应为硬化（如水泥）材质。工作开始前1h，使用75%酒精棉球进行消毒处理，且每日工作前后均需彻底清洁。在室内进行作业时，必须穿戴白色工作服、拖鞋、白帽及口罩，禁止非本岗位人员进入。在无菌环境中，需特别注意设备的清洁度，确保环境无尘、无烟、无蝇、无异味，并避免存放对精子有害的物品。对于参与配种的母牛，应详细记录其繁殖和交配状况。同时，对于配种牛的来源、所在村庄、主人姓名、品种、毛色及年龄等信息也应有详尽地记录。
2、人工授精器械、用具的清洗和消毒
人工授精器械和药品应存放在干净的柜子中，避免与兽药混合。常规器械和药物应放在工作台，用无菌布覆盖。使用前后，用中性洗涤剂或2%碳酸氢钠溶液清洗去除油渍，再用温开水或蒸馏水冲洗2～3次清除杂质。清洗后，将容器倒置排干水分，用干净纱布覆盖防尘。玻璃和金属器械干燥后，可高温消毒或高压蒸汽、沸腾法消毒30min。推荐使用75%酒精擦拭消毒。布料、清洗液、解冻液等应用高压蒸汽或沸腾法灭菌。玻璃输精器和刻度吸管用70%乙醇消毒后，用无菌生理盐水冲洗。注射器、输精器、试管消毒后，用灌洗液冲洗3次，用酒精棉球消毒，无烟火焰烘干。为防疫病传播，消毒输精器仅限单一母牛使用，用后必须重新消毒。
3、牛外阴的消毒问题及推荐方法
没有清洗母牛的外阴，而直接将引精器插入阴道，从而使病菌，甚至是粪便进入阴道。还有的配种员在使用清水或消毒液清洁外阴后，未经干燥就将其插入引精器内，使残留在阴门内的洗涤液进入引精器内，对精液的活性产生影响。有些配种员用毛巾擦拭，重复使用后就成了污染源。建议：用清洁的自来水或水壶冲洗，然后用刷或戴上手套的手搓洗，然后用粗而粗的纸巾把粪便擦干。刷牛阴门时，从阴门中间往外擦，用卫生纸一面擦拭一遍，再用另一面擦拭。在饮水不便的情况下，可用干燥的纸巾擦拭，将污垢擦拭干净。无论采取何种方式，其关键在于要树立无菌、卫生观念，并在手术过程中注意防止污染。
4、输精枪（电器）的使用问题
在使用擦拭细管法或装输精枪（器）时，必须确保手触摸到细管法的前端（一些配种者可能会犯这个错误），然后将输精枪（器）插入管口。在使用颗粒冻精时，一些配种员在为一头母牛输精后，仅用酒精棉球擦拭输精管外部，接着将精液输送到另一头母牛。此外，有些配种员在使用完未清洁消毒的引精器后，会在下一次使用前用酒精棉球擦拭，并用点燃的火焰对输精管进行消毒。然而，他们可能未意识到，这种做法会在输精管内壁形成一层蛋白质变性焦煳，这会损害精子的活性并影响卫生状况。
5、液氮容器的保管、使用
（1）液氮罐的检查
在对新购置的容器进行验收时，必须仔细检查其外观，确保无变形、异常情况、杂质或污渍。若发现油罐外部出现结霜现象，或液氮蒸发量超过既定参考值，应立即查明原因，并采取更换或维修措施。
（2）液氮的充填
在进行注氮操作时，首先应使用少量液氮对容器进行预冷处理，这样做是为了确保罐内已经气化的氮气能够顺利排出。充氮过程应仅限于颈管底端的范围。若容器内存放有冷冻精液，则应在剩余体积的1/3处添加液氮。
（3）冻精的提取和转移
储存冻精的提桶应根据编号准确放置于定位槽内，取用时严禁旋转，提桶的提升高度不得超过颈管的1/3（即10cm），且操作时间应控制在10s以内。若在10s内未能成功取出提桶，请立即将桶或其他包装物浸入液氮中，之后再行取出。精子的快速转移，从一个容器到另一个容器，必须在5s内完成；若计划长期使用，操作过程中应确保精子始终处于液态氮的环境中。
（4）液氮容器的运输
在搬运冻精容器时，必须避免碰撞、倾斜、颠倒或重叠放置。使用汽车运输冻精容器时，除了原有的保护罩外，应额外使用木箱或其他防护设备进行加固。确保垫子厚实柔软，并采取适当的固定措施，以防止在运输过程中发生冲击和碰撞。在进行长距离运输时，需密切监控液态氮的消耗情况，并及时进行补充。
（5）液氮罐的冲洗
配种完成后，务必对液氮罐进行至少一次的清洁工作。对于长期使用的液氮罐，除了清洁之外，还应考虑更换。具体清洁步骤如下：首先旋开盖子，取出管筒，将冻精转移到另一只液氮罐中，然后将剩余的液氮和其他残留物倾倒干净。接着，将液氮罐置于室温下放置2d，以使罐内温度回升至0℃。接下来，使用40～50℃的热水混合中性洗涤剂（或普通洗涤剂）倒入罐内，用抹布彻底擦拭干净，之后将污水倒出。之后需用清水反复冲洗，直至彻底清洁。清洁后，将容器倒置以自然风干或使用热风烘干。
（作者单位：110400 辽宁省沈阳市法库县乡村振兴发展中心）
