摘 要：【目的】研究头孢菌素菌渣有机肥施用后对玉米农田土壤中耐药菌及相关抗性基因丰度的影响，为头孢菌素菌渣有机肥施用生物安全性评价提供科学依据。
【方法】设置不施菌渣有机肥（CK）、施用菌渣有机肥500 kg /667m2（B1）、1 000 kg /667m2（B2）3个处理，分别采用可培养方法和实时荧光定量检测，分析各处理下玉米农田中耐药菌及相关抗性基因丰度变化。
【结果】施用头孢菌素菌渣有机肥能显著提高玉米苗期和结果期土壤中细菌总数及苗期时头孢拉定耐药菌菌数。获得了主要抗生素耐药菌株 41 株，其中，头孢拉定耐药菌 8 株，分属于6个属。
【结论】施用头孢菌素菌渣有机肥能显著提高玉米苗期土壤中各ARGs基因的相对丰度，但在结果期各处理间β-内酰胺类 ARGs基因blaTEM相对丰度无显著影响，并对其它耐药基因无明显规律性影响。
关键词：头孢菌素菌渣；玉米土壤；耐药菌；ARGs；q-PCR
中图分类号：S512 文献标志码：A 文章编号：1001-4330（2024）04-1003-08
0 引 言
【研究意义】抗生素菌渣处理处置方法主要通过物理化学或生物处理，如焚烧、填埋、堆肥、厌氧消化、高温高压热水解、微波、碱处理以及电离辐照等方法，实现菌渣的无害化处理。通过堆肥、厌氧消化、高温高压热水解等处理能有效降低菌渣中残留抗生素，进而资源化利用。【前人研究进展】抗生素生产过程中会形成菌渣［1］。目前，我国抗生素原料药β-内酰胺类抗生素的使用量较大［2，3］。头孢菌素是一种最为常见的β-内酰胺类抗生素［3，4］。菌渣科学处理已受到关注［5-11］。【本研究切入点】目前尚缺少抗生素菌渣肥料化施用土壤后生态风险评估等相关标准与技术规范。有研究表明施用头孢菌素菌渣有机肥后，玉米土壤真菌丰富度和优势度显著降低，潜在致病菌数量下降，但对玉米土壤耐药菌及其抗性基因的影响尚不清楚，有待深入研究［12］。因此，有必要研究头孢菌素菌渣有机肥施用后对玉米农田土壤中耐药菌及相关抗性基因丰度的影响。【拟解决的关键问题】在玉米田设置不同菌渣有机肥施用量处理，在玉米主要生长期检测土壤中的抗生素抗性菌数量和种类，研究不同种类抗生素抗性基因的丰度变化，分析菌渣有机肥施用后农田抗性菌及ARGs基因丰度的变化，为头孢菌素菌渣有机肥施用后对农作物土壤生物安全性评价提供数据基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
试验设在新疆伊犁（37°20′N，116°38′E），选用辽作1号为玉米品种供试，施用肥料为某生物制药企业头孢菌素菌渣无害化处理后制得的有机肥。
1.2 方 法
1.2.1 试验设计
设置不施药渣有机肥对照组（CK），头孢菌素菌渣有机肥施用量500 kg /667m2处理组1（B1），施用量1 000 kg /667m2处理组2（B2），每个处理组面积约为1 334 m2。播种前，将头孢菌素菌渣有机肥作为底肥于当年春季施入试验田，并取样测定土壤头孢菌素及理化性质。表1
1.2.2 样品采集
选择在玉米的出苗期和结果期，按照“梅花五点”法，在每个处理小区选取5个典型样方，采集表层（0～20 cm）土壤，剔除石头、杂草等杂质后，土样用四分法充分混匀后保留2 kg，随即放入装有冰袋的采样箱运回实验室，在24 h内计数抗生素耐药菌，剩余土壤样品-80℃保存，备用。
1.2.3 细菌的培养与计数
取 10 g 土壤样品，置于 100 mL 无菌生理盐水中，120 r /min条件下振荡 10 min，静置 5 min，取 1 mL 土壤悬液按 10 倍系列稀释后，取适宜稀释度土壤悬液100 μL，涂布于相应培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养48 h，并进行菌落计数。其中，总菌数计数使用营养琼脂平板，耐药菌的计数和筛选采用 50 μg/mL的硫红霉素、青霉素、头孢拉定的抗性营养琼脂平板。
1.2.4 耐药细菌的挑选及分子鉴定
耐药菌挑选根据抗性平板中菌落形态、颜色、大小等进行挑选，并在对应的抗性平板上划线纯化，于30℃恒温培养箱培养，连续纯化培养，直至获得单菌落。
纯化后单菌落采用菌落 PCR 方法，选用细菌 16S rDNA 序列通用引物 27F 和 1492R 进行耐药菌 PCR 扩增［13］。PCR 产物经天根胶回收试剂盒（TIANgel Midi Purification Kit）切胶纯化后，送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序所得菌株序列到 NCBI 数据库与BLAST 进行比对。
1.2.5 ARGs检测基因及扩增
选取典型耐药基因β-内酰胺类ARGs（blaTEM）、红霉素类 ARGs（ermB、ermF）、磺胺类 ARGs（sul1、sul2）等5种作为目标检测基因，并由生工生物工程（上海）有限公司合成。
以快速提取试剂盒（Fast DNA Spin Kit for Soil）提取土壤总 DNA 为模板，参照王佳佳［14］、朱玥晗［15］方法，进行 ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2目的基因的 PCR 扩增。PCR 产物经切胶纯化后，送至生工生物工程（上海）有限公司测序，测序所得序列经NCBI 数据库进行 BLAST 比对产物准确性。表2
1.2.6 不同ARGs的qPCR标准曲线绘制
抗性基因PCR 纯化产物与 pMD19-T 载体连接，并转入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂布于50 μg/mL 氨苄青霉素抗性培养基平板，37℃恒温培养。挑取潜在阳性单克隆，接种于含 50 μg/mL 氨苄青霉素抗性的 LB 液体培养基中，37 ℃ 震荡培养过夜，采用天根质粒小提试剂盒（TIAN Pure Midi Plasmid Kit）提取质粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
对鉴定正确的抗性基因质粒，采用 Biotek Epoch 微孔板分光光度计（美国） 检测浓度以及纯度，根据浓度值计算基因拷贝数［16］。质粒 DNA 按 10 倍梯度稀释作为定量标准品反应模版，参照 qPCR 试剂盒（Quanti Nova SYBR Green PCR Kit）条件进行扩增，反应体系为：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，Forward Primers 0.25 μL，Reverse Primers 0.25 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，模板 1 μL，ddH2O 7.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性 4 min，94 ℃，30 s；54 ℃， 30 s；72 ℃，30 s；30 个循环；72℃终延伸 10 min。分析各基因序列在不同浓度 PCR 扩增的 Ct 值。以拷贝数的 log 值为横坐标，Ct 值为纵坐标绘制标准曲线，计算曲线方程。
1.2.7 土壤ARGs的定量
分别以各土壤 DNA 为模版，进行不同基因qPCR 扩增。待 qPCR 扩增结束后，明确各土壤样品 qPCR扩增的 Ct 值，并通过标准曲线计算得到土壤样品中目的基因的绝对含量。
1.3 数据处理
利用 Excel 软件对常规数据进行整理、汇总，采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，选用 GraphPad Prism 8.0.1 进行绘图。
2 结果与分析
2.1 不同处理对土壤细菌数量的影响
研究表明，玉米不同生育期可培养细菌菌落数及抗生素耐药菌菌落数之间存在一定差异。在苗期土壤样品中，施加了头孢菌素菌渣有机肥的土壤细菌总数、头孢拉定耐药菌和硫红霉素耐药菌均显著高于对照组，而青霉素耐药菌菌落数差异不显著；到了结果期，施加了头孢菌素菌渣有机肥的土壤中细菌总数呈现显著增加，而硫红霉素耐药菌显著降低，而关孢拉定耐药菌数量与对照组无显著差异。表3
2.2 土壤中抗生素耐药菌的种属构成
研究表明，共获得各类耐药菌株 41 株，其中，头孢拉定耐药菌 8 株，青霉素耐药菌 30 株，红霉素耐药菌 3 株。共获得 8 株头孢拉定耐药菌，分布于 6 个种属，其中假单胞菌属和短杆菌属各 2 株，占总菌株数的 25%；所得青霉素耐药菌株为11 个菌属，其中，链霉菌属菌株数最多，达到 14 株，占总菌株数 的 46.67%；获得 3 株红霉素耐药菌，其中 2 株为假单胞菌。表4
2.3 不同 ARGs 及16S rDNA标准曲线绘制
研究表明，各扩增基因的标准曲线线性回归方程相关系数 R2均高于 0.99，各基因浓度与 qPCR 的 Ct 值线性相关性较好。表5
2.4 施用有机肥后土壤中 ARGs 的绝对丰度
研究表明，施用头孢菌素有机肥后，土壤中细菌总数在苗期影响不显著，而在结果期是B1处理较其它处理存在显著增加。在抗生素耐药性基因方面，玉米不同生长时期各类 ARGs 之间存在一定差异，不同处理下 β-内酰胺类ARGs（blaTEM）拷贝数均明显高于红霉素类 ARGs（ermB、ermF）和磺胺类 ARGs（sul1、sul2）。在出苗期，BlaTEM绝对拷贝数随着有机肥施用量的增加显著增加，而到结果期时，仅B2处理较其它处理存在显著差异。磺胺类ARGs基因sul1、sul2的拷贝数在苗期时存在一定程度的降低，而在结果期时明显增加，尤其是B2处理较其它处理显著增加。红霉素类 ARGs基因ermB、ermF拷贝数对各个处理的不同时期均表现出差异不显著。表6
2.5 施用有机肥后土壤中ARGs的相对丰度
研究表明，施用了头孢菌素菌渣有机肥的玉米土壤中，各 ARGs基因相对丰度之间存在明显差异；苗期玉米土壤中各ARGs（blaTEM）基因随着施用量的增加相对丰度显著增加，其中， blaTEM在低量添加B1处理中相对丰度较对照CK表现为显著（P＜0.05），在低量添加B1处理中相对丰度较对照CK表现为较显著（P＜0.01）；而红霉素类 ARGs基因ermB、ermF和磺胺类 ARGs基因sul1、sul2相对丰度表现出极显著（P＜0.000 1）。在结果期，各处理中blaTEM相对丰度较对照CK差异不显著；红霉素类 ARGs基因ermB、ermF相对丰度均表现出高添加B2处理较对照CK极显著增加（P＜0.000 1）；磺胺类 ARGs基因sul1、sul2相对丰度却在不同处理表现不同，sul1相对丰度在低添加B1处理时较对照呈现极显著增加（P＜0.000 1），而sul2相对丰度在高添加B2处理时较对照呈现极显著增加（P＜0.000 1）。图 1～3
3 讨 论
3.1
抗生素菌渣通过有效处理进行肥料化可实现资源再利用，但是，如果菌渣在发酵过程中处置不完全，生产的有机肥中可能会有残留抗生素和中间代谢产物等［17，18］。试验所施用的头孢菌素菌渣无害化处理制得有机肥作为底肥的玉米田后，均未发现头孢菌素残留，其菌渣无害化肥料处理较为有效。
3.2
尽管在菌渣有机肥发酵无害化处理可以有效降解残留抗生素或中间代谢产物，但发酵过程中菌渣残留抗生素和中间代谢产物会对相关抗性菌群筛选和富集，可带来潜在抗生素耐药基因的富集和污染［5，6］。不同无害化处理过程对菌渣中抗生菌耐药基因的影响不同，其形成的有机肥对环境影响也不同。周睫雅［3］对头孢菌素菌渣肥料化利用进行分析，发现通过水热预处理喷雾干燥菌渣肥无抗生素残留检测出，但施用有机肥处理组中菌落总数明显升高，菌群组成发生明显变化，检测的所有抗性基因和可移动元件相对丰度均高于对照组，但与施用其它有机肥相比无显著差异。张涛等［9］对头孢菌素发酵菌渣利用电子束辐照-好氧堆肥无害资源化处理后，发现堆肥10 d抗生素残留即无法液相色谱检出，但堆肥过程中抗性基因erm B丰度有所减小，sul2丰度升高，有机肥施用过程中，对陆地生态系统基本无害。研究中，施加头孢菌素菌渣有机肥的玉米不同生长期的土壤细菌总数显著高于对照组，其结果与Zhou等［19］报道一致；但采用实时荧光定量PCR检测其细菌总数增加不显著，表明通过施肥有效提升土壤中可培养菌群的数量，但土壤中总体微生物数量增加有限。
3.3
对耐药基因相对丰度进行分析，发现在玉米苗期土壤中β-内酰胺类 ARGs基因blaTEM、红霉素类 ARGs基因ermB、ermF和磺胺类 ARGs基因sul1、sul2相对丰度较对照CK均表现出显著增加，与周睫雅［19］相关研究一致。平然［20］也发现施用硫酸新菌素菌渣有机肥可明显提高硫酸新霉素抗性基因acc（6）ib相对丰度，但显著低于商品有机肥施用土壤，相关耐药性基因的增加可能因有机肥的施入通过肥效作用激活相关微生物，导致土壤微生物群落组成的改变，提高土壤中相关耐药菌的增加，进而导致相关耐药基因增加。在研究玉米结果期时，β-内酰胺类 ARGs基因blaTEM相对丰度与对照相比差异不显著，其它相关耐药性尽管在各处理中也有不同程度的显著增加，但与施肥量呈现规律性对应。
4 结 论
施用不同浓度的头孢菌素菌渣有机肥能显著提高玉米不同时期的细菌总数，明显提高了苗期时头孢拉定耐药菌菌数。获得了主要抗生素抗性菌株耐药菌株 41 株，其中，头孢拉定耐药菌 8 株，分属于6个属。施用头孢菌素菌渣有机肥对玉米苗期土壤中三种常见ARGs的相对丰度有显著提高，在结果期对β-内酰胺类 ARGs基因blaTEM相对丰度无显著影响。
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