摘 要：【目的】研究新疆野生巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖提取及多糖脱色工艺，为新疆野生巴尔喀什蘑菇多糖的纯化及深度开发提供理论依据和技术支持。
【方法】釆用热水提醇沉法提取巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖，研究提取温度、时间、次数对巴尔喀什蘑菇多糖得率的影响；选择脱色时间、脱色温度、活性炭和H2O2含量为影响因子，以多糖脱色率为研究指标，采用正交试验优化巴尔喀什蘑菇多糖脱色工艺，确定最佳脱色工艺条件。
【结果】热水提醇沉法提取巴尔喀什菇子实体粗多糖的最佳工艺条件：提取时间6 h、提取温度60℃、提取次数2次，在此条件下巴尔喀什菇子实体粗多糖得率为15.6%。活性炭最佳脱色工艺为活性炭用量 25%、脱色温度 60℃、脱色时间45 min、pH值 3，在此条件下脱色率 为80.4%；双氧水最佳脱色工艺为H2O2含量10%、脱色温度60℃、脱色时间3 h、pH值9 ，在此条件下脱色率为86.23%。
【结论】利用热水提醇沉法提取巴尔喀什蘑菇粗多糖工艺具有实际应用价值。H2O2脱色法和活性炭脱色法对巴尔喀什蘑菇多糖的脱色效果受不同工艺条件的影响差异较大，H2O2脱色率比活性炭脱色率高，是巴尔喀什蘑菇多糖脱色的可行方法。
关键词：巴尔喀什蘑菇；多糖提取；活性炭脱色；双氧水（H2O2）脱色
中图分类号：S646"" 文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）06-1527-08
0 引 言
【研究意义】巴尔喀什蘑菇（Agaricus balchaschensis）是新疆特有的大型野生食用菌，生长在新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖县博斯腾湖边红柳芦苇根部的沙土层内，具有高蛋白、低脂肪、富含碳水化合物及矿物质营养等特点，其营养水平高于常见的双孢菇、平菇、香菇［1］。巴尔喀什蘑菇的多糖具有免疫调节作用［2］。但是，目前关于巴尔喀什蘑菇的研究侧重于资源调查和子实体培养方面 ［3、4］，而对其子实体多糖的提取和脱色工艺研究匮乏。因此，优化巴尔喀什蘑菇多糖提取、脱色工艺是新疆野生巴尔喀什蘑菇的高效开发利用的基础。真菌多糖具有参与调节免疫功能、细胞间物质识别等多种生物活性作用 ［5］ ，但是，多糖中的色素会直接影响多糖的纯度、外观颜色和生物活性［6］。多糖提取、脱色是研究利用巴尔喀什蘑菇的重要基础，因此，建立高效、经济的巴尔喀什蘑菇子实体多糖提取、脱色工艺，对新疆野生巴尔喀什蘑菇资源的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】食用真菌多糖是众多生物活性糖蛋白的一种［7］。多糖具有极性，在热水中容易溶解。热水提醇沉法能够有效提取真菌子实体多糖，料液比、浸提温度和浸提时间是影响真菌子实体多糖提取效率的主要影响因子［8］。杨青松等［9］利用响应面法优化了水浸提法提取红雪茶水溶性多糖的工艺条件，发现在温度82℃、料液比1∶20的条件下提取2 h，提取率为5.8%。热水提醇沉法虽然耗时较长，但是步骤简便、成本低、杂质含量少，是目前提取游离态多糖的最常用方法 ［10］。脱色是粗多糖精制的重要步骤之一，主要脱色方法有活性炭吸附法、双氧水脱色法、大孔树脂脱色法等［11］。谢建华等［12］研究发现，利用活性炭对青钱柳叶多糖的脱色率及多糖保留率分别可达 80.3%和55.6%。但是活性炭脱色后存在难于分离的缺点，而H2O2 通过氧化剂的氧化作用进行漂白脱色，具有自动分解、适合工业化生产等优点。该方法脱色后不易复色，主要适用于色素多且含有不饱和双键、羟基和芳香环的物质［13-14］。【本研究切入点】目前尚未见有关新疆野生巴尔喀什蘑菇子实体多糖脱色工艺的研究报道。需研究筛选提高新疆野生巴尔喀什蘑菇子实体多糖提取率和脱色率方法。【拟解决的关键问题】优化巴尔喀什蘑菇子实体多糖水浸提醇沉法工艺条件，利用单因素正交试验优化巴尔喀什蘑菇多糖的活性炭和H2O2脱色工艺，为新疆野生巴尔喀什蘑菇多糖的纯化及其资源深度开发提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材 料
供试的野生巴尔喀什蘑菇子实体，采摘于新疆博湖县博斯腾湖南岸。
试剂：无水乙醇、活性炭、H2O2均为分析纯。
仪器：UV-全波段分光光度计、UV- 1061 酶标仪计
1.2 方 法
1.2.1 巴尔喀什蘑菇粗多糖提取
参照杨青松等［9］热水浸提醇沉法，将巴尔喀什蘑菇子实体切片、烘干、粉碎，过80目筛，称取10 g子实体粉末，加入1 000 mL蒸馏水中，对提取温度（50、60、70、80、90℃）、提取时间（4、5、6、7、8 h）、提取1、2、3、4次分别进行多糖提取单因素试验，提取后在8 000 r/min的转速下离心20 min，取上清液，加入3倍体积95%无水乙醇，充分搅拌，静置过夜、抽滤，所得沉淀即为粗多糖，在45℃烘箱中烘干，计算多糖含量。
1.2.2 多糖测定［15］
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标准品，依据《中华人民共和国药典》［16］ 制作标准曲线。将巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖提取液，配成浓度均为 1 mg/mL溶液，取0.2 mL在 UV- 1061 酶标仪计上，在可见波长200～600 nm范围内测定吸光度，以横纵坐标分别为波长、绘制标准曲线，以蒸馏水为对照。精确吸取1 mL多糖测定液测定多糖含量。
粗多糖中总糖含量可根据标准曲线计算。
式中，C为根据标准曲线计算出的结果，V为提取液总体积， M为实际称量质量。
1.2.3 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖活性炭脱色法
选择活性炭为脱色剂，设置4个单因素：活性炭用量、脱色温度、脱色时间和pH 值。使用紫外可见分光光度计检测490 nm处脱色前后的巴尔喀什蘑菇多糖溶液的吸光值。
式中，A1：多糖溶液脱色前于490 nm 处的吸光度；A 2：多糖溶液脱色后于490 nm 处的吸光度。
1.2.3.1 活性炭加入量对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，分别加入5%、10%、15％、25％、30%和35％活性炭，pH值调为4，置于60℃水浴锅中，脱色45 min，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.3.2 时间对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，分别加入30%活性炭（根据1.2.3.1结果加入最佳量活性炭），pH值为4，置于60℃水浴锅中，脱色15、25、35、45、55和65 min，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.3.3 温度对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，分别加入30%活性炭，pH值调为4，置于40、50、60、70、80和90℃水浴锅中，脱色30 min，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.3.4 pH值对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，分别加入30%活性炭，将pH值调为2、3、4、5、6和7，置于60℃水浴锅中，脱色45min，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.4 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖H2O2脱色法 ［17］
选择H2O2为脱色剂，设置4个单因素：H2O2用量、脱色温度 、脱色时间和pH值。
1.2.4.1 H2O2加量对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，将pH值调为9，分别加入4%、6%、8％、10％和12％的H2O2溶液2 mL，置于60℃水浴锅中， 保持3 h，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.4.2 温度对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，将pH值调为9，分别加入10%" H2O2 2 mL，置于30、40、50、60和70℃水浴锅中，保持3 h，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.4.3 温浴时间对脱色的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，将pH值调为9，分别加入10% H2O2溶液2 mL，置于60℃水浴锅中，分别保持0.5、1、2、3和4 h，离心取上清，重复3次，测定吸光值。
1.2.4.4 pH值对多糖脱色效果的影响
分别在5个20 mL的离心管中移取巴尔喀什蘑菇子实体多糖溶液10 mL，将pH值分别调为8、9、10、11和12，加入10% H2O2 2 mL，置于60℃水浴锅中，保持3 h，离心取上清，重复操作3次，测定吸光值。
1.2.5 正交试验
1.2.5.1 活性炭脱色正交试验
通过单因素试验，选取活性炭含量、脱色时间、脱色温度以及pH值作为研究对象，按照L9（34 ）设计进行正交试验，以确定活性炭脱色影响因素及水平。表1
1.2.5.2 H2O2脱色正交试验
通过单因素试验，选取脱色温度、脱色时间、pH值以及H2O2用量作为研究对象，按照 L9（34 ）设计进行正交试验［18］ ，确定H2O脱色影响因素及水平。表2
2 结果与分析
2.1 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖提取影响因素
研究表明，热水浸提法提取巴尔喀什蘑菇粗多糖，所选取的三个因素对粗多糖提取的影响顺序依次为提取时间＞提取温度＞提取次数。提取时间对粗多糖提取率影响极显著，提取温度对粗多糖提取率影响显著，提取次数对粗多糖提取率影响不显著。最终得到粗多糖最佳提取工艺条件为提取时间6 h、提取温度60℃、提取次数2次，在此条件下的粗多糖提取率达到15.6%。图1
2.2 标准曲线的建立
研究表明，以吸光度（A）为横坐标，葡萄糖糖浓度（y）为纵坐标建立标准曲线，得到线性回归方程：Y=210.41X-12.379，R2=0.999 3。图2
2.3 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖活性炭脱色效果
2.3.1 活性炭添加量对多糖脱色效果的影响
研究表明，在设定范围内，随着活性炭加入量的增加，巴尔喀什蘑菇多糖脱色率逐渐增加，当活性炭加入量从5%增加到30%时，多糖脱色率从14.29%增加到24.57%；当活性炭浓度超过30%时，多糖脱色率下降至19.25% 。选择25%、30%、35% 三个水平的活性炭加入量进行正交试验。图3
2.3.2 脱色温度对多糖脱色效果的影响
研究表明，在设定范围内，随着脱色温度的升高，多糖脱色率呈逐渐增加又缓慢降低的趋势，当温度为60℃时，多糖脱色率最高，为90.42％，当温度为70℃时多糖脱色率降低至89.35%，选用40、50和60℃三个水平进行正交试验。图4
2.3.3 脱色时间对多糖脱色效果的影响
研究表明，随着脱色时间的延长，多糖脱色率呈逐渐升高后降低的变化趋势，当脱色时间为45 min时脱色率最高，达88.14%。在55、65 min时脱色率均低于45 min时。根据试验结果选择35、45和55 min 三个水平进行正交试验。图5
2.3.4 pH值对多糖脱色效果的影响
研究表明，当pH值由2增加到3时，脱色率高，分别为 61.27%和 74.07%；当pH值由4～7时，多糖脱色率大幅降低，当pH值6时脱色率最低，为12.63% 。pH值2、3、4 三个水平进行正交试验。图6
2.4 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖 H2O2脱色单因素
2.4.1 "H2O2加量对多糖脱色效果的影响
研究表明，随着H2O2的增加，巴尔喀什蘑菇粗多糖脱色率逐渐升高，当H2O2加量从4%增加到12%时，粗多糖脱色率由63.36%增加到70.57%。当H2O2加量超过12%时，多糖脱色率变化不大。选择8%、10%、12%三个水平的H2O2加入量进行正交试验。
2.4.2 脱色温度对多糖脱色效果的影响
研究表明，当脱色温度从40℃升至60℃时，多糖脱色率由68.52%升至77.04%。当脱色温度超过60℃时，多糖脱色率下降。根据试验结果选择40、50、60 ℃ 三个水平的脱色温度进行正交试验。
2.4.3 脱色时间对多糖脱色效果的影响
研究表明，脱色时间在0.5～3 h，巴尔喀什蘑菇多糖脱色率随时间的增加而上升，脱色率从50.37%增加到73.74%。当脱色时间超过3 h后脱色率下降。根据试验结果选择 1、2、3 h三个水平的脱色时间进行正交试验。
2.4.4 pH值对多糖脱色效果的影响
研究表明，当pH值由8增加到10时，脱色率略有提升，从52.5％增加到68.2％。当pH值超过11时，脱色率下降至46.18。选择pH值8、9、10三个水平进行正交试验。
2.5 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖活性炭脱色
研究表明，活性炭脱色法各因素对巴尔喀什蘑菇多糖脱色影响的主次顺序为 C＞D＞B＞A，即温度＞pH值＞时间＞活性炭加量；最优水平为 A1B2C2D2 ，即脱色温度 60℃、脱色时间45 min、活性炭加量25%、pH=3，此条件下巴尔喀什蘑菇粗多糖脱色率最高，达80.4%。表3
2.6 巴尔喀什蘑菇子实体粗多糖H2O2脱色
研究表明，H2O2脱色法各因素对巴尔喀什蘑菇多糖脱色影响的主次顺序为B＞A＞D＞C，即时间＞温度＞H2O2加量＞pH值；最优水平为 A2B3C1D2 ，即脱色温度 60℃、脱色时间3h、H2O2 加量10%、pH=9。此条件下巴尔喀什蘑菇粗多糖脱色率最高，达86.23%。表4
3 讨 论
3.1 食用菌多糖的提取方法较多，主要有热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法、超声波法、复合酶解法等 ［ 19］ 。稀酸稀碱会破坏多糖的糖苷键，使多糖分子内部发生断裂，影响多糖获得率，而且杂质含量多，影响后期的纯化过程。热水浸提法虽然耗时较长，但步骤简便、成本低、杂质含量少，适用于游离态多糖的提取，是目前最常用的多糖提取方法 ［10］。
试验研究采用热水提醇沉法提取巴尔喀什蘑菇粗多糖，对提取温度、提取时间、提取次数等关键因子影响巴尔喀什蘑菇粗多糖获得率进行了研究，优化出多糖提取的最佳条件是在60℃下提取6 h，提取2次，在此条件下巴尔喀什菇子实体多糖获得率为15.6%，高于常昕等［20］提取芦苇黑蘑菇多糖的获得率。研究表明，利用热水提醇沉法提取巴尔喀什蘑菇多糖可行， 利用热水浸提法从巴尔喀什蘑菇提取的粗多糖含有杂质色素，纯度较低，影响多糖的结构解析及生物活性研究，使多糖的应用受到限制。Gao等［21］发现粗多糖经精制后，抗氧化活性明显提高，而对多糖进行脱色、纯化是其中最为关键的一个环节，可提高粗多糖有效成分的纯度，同时经纯化获得的多糖可为后续的结构分析、药理和构效关系提供试验材料。目前，多糖脱色主要有活性炭脱色法、树脂脱色法、双氧水脱色法等［20］。活性炭脱色具有操作简单、价格低廉等优点，但是，在操作时必须使用粉末活性炭，导致脱色后溶液中的活性炭残渣难以完全去除。且活性炭吸附色素的同时，也会吸附多糖，造成多糖的损失。同时脱色时溶液的pH值需调至3左右，将由于加酸而导致多糖变质［22］。H2O2 脱色法虽然成本低、脱色工艺稳定且效率较高，但H2O2对多糖具有较强的氧化作用。蒋俊等［11］研究活性炭吸附法、H2O2 脱色法和大孔树脂法对猴头菌多糖的脱色效果发现，高浓度的H2O2脱色效果能达到与大孔树脂相当的水平。陈健等［23］采用树脂脱色法和H2O2脱色法对香菇多糖进行脱色发现，H2O2法脱色时间短、多糖保留率高，且香菇多糖分子量不受H2O2脱色工艺的影响，脱色效果优于树脂法。试验对活性炭脱色和双氧水脱色两种方法的脱色时间、脱色温度及活性炭或H2O2添加量进行了研究，采用正交试验优化得出巴尔喀什蘑菇子实体多糖脱色的最佳工艺。活性炭脱色法各因素对巴尔喀什蘑菇多糖脱色影响的主次顺序为温度＞pH值＞时间＞活性炭加量，最优水平为脱色温度 60℃、脱色时间 3h、活性炭加量25%、pH值 3，此条件下多糖脱色率最高，达80.4%。双氧水脱色法各因素对多糖脱色影响的主次顺序为时间＞温度＞H2O2加量＞pH值；最优水平为脱色温度 60℃、脱色时间 3h、H2O2添加量 10%、pH值9，此条件下多糖脱色率最高，达86.23%，与蒋俊等利用不同脱色方法对猴头菌多糖进行脱色的研究结果［11］一致。下一步拟对巴尔喀什蘑菇子实体多糖的纯化及理化特征进行深入研究。
4 结 论
利用热水提醇沉法提取野生巴尔喀什菇子实体多糖的最佳工艺条件：在60℃条件下提取6 h，提取2次，在此条件下巴尔喀什菇子实体多糖获得率达15.6%。活性炭脱色和H2O2脱色的最佳工艺条件：活性炭添加量25%、脱色温度60℃、脱色时间45 min、pH=3，在此条件下多糖脱色率达 80.4%； H2O2添加量10%、脱色温度60℃、脱色时间3 h、pH= 9，在此条件下多糖脱色率达86.23%。2种脱色方法的脱色效果存在显著差异，H2O2脱色法对巴尔喀什蘑菇多糖的脱色效率较高，工艺稳定，是新疆野生巴尔喀什蘑菇多糖脱色的可行方法。
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Extraction and decolorization of polysaccharides from fruit body of wild Agaricus balchaschensis in Xinjiang
Abstract：【Objective】 To study the extraction and decolorization process of crude polysaccharides from fruit body of wild Agaricus balchaschensis in Xinjiang， and provide theoretical basis and technical support for its in-depth development.
【Methods】 This study adopted ethanol subsiding to extract the fruit body polysaccharides of wild A. balchaschensisin， and explored the influence of extraction temperature， time and frequency on the yield of polysaccharides from A. balchaschensisin." With the decolorization time， decolorization temperature， content of activated carbon and H2O2 as influencing factors and the decolorization rate of polysaccharides as research index， the study optimized the decolorization process of polysaccharides from A. balchaschensisin through orthogonal test， so as to determine the optimal decolorization conditions.
【Results】" According to the results， the optimal conditions for extracting fruit body polysaccharides of wild A. balchaschensis by ethanol subsiding were 6 h extraction time， 60℃ extraction temperature， and 2 times extraction， under which the yield of fruit body polysaccharides of wild A.balchaschensisin was 15.6%. The optimal decolorization process for activated carbon was 25% activated carbon， 60℃ decolorization temperature， and 45 min decolorization time at pH3， under which the decolorization rate was 80.4%. The optimal decolorization process for hydrogen peroxide was 10% H2O2 content， 60℃ decolorization temperature， and 3 h decolorization time at pH 9， under which the decolorization rate was 86.23%.
【Conclusion】" This technology has verified the feasibility and practical value of applying ethanol subsiding to extract fruit body polysaccharides of wild A.balchaschensis in and the effects of H2O2 and activated carbon decolorization methods on the decolorization of polysaccharides from A. balchaschensis varied greatly under different process conditions. The former has a higher decolorization rate than the latter and is feasible for the decolorization of polysaccharides from A.balchaschensisin.
Key words：Agaricus balchaschensis;carbon; hydrogen peroxide （H2O2 ）" decolorization
