摘 要：【目的】研究新疆某规模化牛场犊牛腹泻症的主要病原。
【方法】采用RT-PCR方法，检测14份腹泻犊牛粪便中的病毒，对4头死亡犊牛肝组织进行细菌分离培养及鉴定、小鼠致病性和药物敏感性试验。将分离的致病菌扩增16S rDNA基因片段并测序，并将其结果在NCBI中用BLAST搜索同源序列，分析遗传进化特性。
【结果】该牛场犊牛腹泻的病原为牛冠状病毒（Bovine coronavirus， BCoV）、牛轮状病毒（Bovine rotavirus， BRV）、大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli， E.coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae， K.pneumoniae）。14份粪便中，BCoV检出率为64.29%，BRV检出率为50.00%；4份肝组织中， E.coli检出率为100.00%，K.pneumoniae检出率为50.00%。分离的2种致病菌E.coli和K.pneumoniae对阿米卡星敏感，对其它16种抗生素均耐药。
【结论】该牛场引起犊牛腹泻的主要病原为BCoV、BRV、E.coli和K.pneumoniae，存在病毒与细菌的混合感染。选择阿米卡星药物防治E.coli和K.pneumoniae。
关键词：犊牛腹泻；病原学；检测；鉴定
中图分类号：S858.23"" 文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）06-1535-09
0 引 言
【研究意义】犊牛腹泻是多因素引起的以腹泻为主要特征的症候群。犊牛感染后，生产性能下降、死亡率高［1-2］。预防是减少疾病发生的有效方法，而监测病原体是重要的预防措施之一［3］。引起犊牛腹泻的主要肠道病原体包括病毒［如：BRV、BCoV、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhoea virus，BVDV）、牛环曲病毒（Bovine torovirus，BToV）、牛诺如病毒（Bovine norovirus，BNoV）、牛纽布病毒（Bovine nebovirus，BNeV）］、细菌（如沙门氏菌、E.coli、产气荚膜梭菌）和原生动物（如微小隐孢子虫）［4-9］。犊牛腹泻的病因多而复杂，病原差异大，仅凭临床症状难以确诊，需要通过试验检测查明病原。【前人研究进展】犊牛腹泻的病原检测已有报道［4-12］，有文献报道该病原主要为病毒和细菌，病毒主要为BCoV和BRV，细菌主要为不同种的E.coli［13-21］，其中吴静等［17］认为新疆4地犊牛腹泻的主要病原为BCoV、BNoV、产志贺毒素大肠杆菌（STEC），并对分离株STEC作了药物敏感性试验。彭龙［18］检测到新疆部分地区的主要病原为BCoV、BRV、BVDV和E.Coli，结合药物敏感性试验结果，对其中一个牛场对因、对症、辅助治疗后，腹泻犊牛痊愈。【本研究切入点】新疆某规模化牛场犊牛出生第7 d左右时，出现腹泻，临床症状为排黄色水样恶臭稀便、严重便血、脱水、衰弱甚至急性死亡等，发病率为90%，死亡率为70%，急需对病原开展检测和鉴定。【拟解决的关键问题】收集14头腹泻犊牛粪便，和其中4头死亡犊牛肝组织，检测与鉴定病原14头腹泻犊牛的粪便对该牛场开展病毒检测及鉴定。中的病毒，对其中4头死亡牛的肝组织进行细菌分离培养及鉴定，确定致病原因，并将分离的致病菌进行小鼠致病性试验和药物敏感性试验，为腹泻犊牛的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 病样来源
自2022年12月5日开始，新疆某规模化牛场出生的犊牛，于出生后第7 d左右，发生腹泻，大多数死亡。将14头腹泻犊牛的粪便分别置于50 mL无菌管内，对其中的4头死亡牛，采集肝组织，-20℃ 运输至实验室，-80℃保存备用。
1.1.2 主要试剂
病毒基因组RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR扩增试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司； DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；培养基购自北京索莱宝科技有限公司；药敏纸片购自英国Oxford公司。
1.2 方 法
1.2.1 RT-PCR检测病毒
1.2.1.1 引物设计与合成
采用软件Oligo6.0，参考GeneBank中序列（登录号：KC853440.1、OP866729.1、NC029645.1）分别设计BVDV、BCoV和BNoV基因扩增引物。牛肠道病毒（Bovine enterovirus，BEV）、BRV的引物分别参照文献［22-23］合成。引物均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。表1
1.2.1.2 样品总RNA提取
粪便样品经PBS液稀释后，反复冻融3次，于12 000 r/min离心10 min，取上清，按照RNA提取试剂盒说明书操作。
1.2.1.3 RT-PCR扩增
根据一步法RT-PCR试剂盒说明书操作进行扩增。反应体系：模板3 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物各2 μL，去离子水（ddH2O）补足50 μL。反应条件：反转录50℃ 30 min；94℃预变性2 min；94℃ 30 s，退火20 s，72℃延伸（按1 min/kb计算时间），30个循环；72℃延伸10 min。取10 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.1.4 目的片段回收、测序
RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，将目的条带按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收纯化，送通用生物（安徽）股份有限公司测序。将测序结果在NCBI中比对。
1.2.2 细菌的分离鉴定
1.2.2.1 引物合成
细菌16S rDNA基因通用引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。表2
1.2.2.2 细菌的分离培养
无菌条件下，分别在4份犊牛腹泻症肝脏的病健交界处多点剪取适量样品，每份样接种一套培养基（麦康凯培养基、脑心浸出液肉汤（BHI）培养基和 SS 琼脂培养基），共4套培养基，37℃ 恒温过夜培养。
1.2.2.3 分离菌的鉴定
根据菌落形态差异，次日在每套平板上随机挑取3个单菌落，先在BHI平板上划线保菌，再以少许菌作为模板，采用细菌通用引物进行菌落PCR，扩增16S rDNA基因，设阴性对照。反应体系为50 μL，挑取少许菌落为模板，2×Premix Ex Taq 25 μL，上、下游引物各2 μL，去离子水补足50 μL。反应条件：94℃预变性6 min；94℃ 30 s，55℃退火20 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min。取10 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性产物测序。将测序结果在NCBI中用BLAST搜索同源序列进行分子鉴定。
1.2.2.4 小鼠致病性试验
将鉴定为疑似具有致病性的分离菌分别接种于LB液扩菌培养，37℃ 225 r/min过夜振荡，作为攻毒菌；每1菌株为1组。取20～30 g重BALB/c小鼠随机分组作为攻毒动物，5只/组。腹腔注射新鲜菌液0.2 mL/只（1×109 CFU/mL），另设对照组注射相同体积生理盐水。注射后每隔1 h记录小鼠发病死亡情况。
1.2.2.5 回收菌的分离培养及鉴定
无菌条件下，将死亡小鼠肝组织在BHI平板上涂板划线，37℃恒温过夜培养，获得回收菌。次日挑取单菌落进行菌落PCR，扩增16S rDNA基因，将PCR产物测序。将测序结果在NCBI中用BLAST搜索同源序列，并与攻毒菌16S rDNA序列比对，进行遗传进化分析。
1.2.2.6 药敏试验
将从死亡小鼠肝脏分离的回收菌，参照文献［24-25］纸片扩散法，选取17种抗生素进行药敏试验。以ATCC 25922为E.coli的质控菌株，以ATCC 700603为K.pneumoniae 的质控菌株。
2 结果与分析
2.1 病毒RT-PCR检测
研究表明，在478 bp处扩增出BCoV目的序列，在1 356 bp处扩增出BRV目的序列，两者大小与预期相符。所有样品均未扩增出BVDV、BNoV和BEV的目的条带。分离的BCoV序列与NCBI中同源序列一致性为99%左右，分离的BRV序列与NCBI中同源序列一致性为99%左右，检测到BCoV和BRV。图 1
2.2 细菌的分离、培养及鉴定
研究表明，1号～8号、10号菌序列相同，为同一菌株，命名为分离株A；9号、11号～12号菌序列相同，为同一菌株，命名为分离株B。分离株A与前100株E.coli的序列一致性在99.79%（GeneBank登录号：OQ891229.1）～99.93%（GeneBank登录号：AP024126.1），下载默认排序的前20条序列，构建系统发育进化树，A与登录号为CP104618.1、AP027971.1和AP027256.1的菌株处于一小分支，与其它E.coli处于一大分支。将分离株A命名为E.coli Bachu-1/Xinjiang/China。分离株B与前100株K.pneumoniae的序列一致性在99.51%（GeneBank登录号：CP103727.1）～99.58%（GeneBank登录号：CP052372.1），下载默认排序的前17条序列，构建系统进化树，B与登录号为KU212145.1的菌株处于一小分支，与其它肺炎克雷伯氏菌处于一大分支。将分离株B命名为K.pneumoniae Bachu-1/Xinjiang/China。图2～4，表3
2株菌均为革兰氏阴性菌，分离株A为无芽孢的直杆菌、中等大小、两端钝圆，散在或成对，符合大肠埃希氏杆菌特点；分离株B为较粗短的直杆菌，单个、成对或短链状排列，有明显荚膜，符合肺炎克雷伯氏菌特点。分离株A符合大肠埃希氏杆菌特性，分离株B符合肺炎克雷伯氏菌特性。分离株A为E.coli，分离株B为K.pneumoniae。所有SS平板上未培养出沙门氏菌和志贺氏菌。图5
2.3 小鼠致病性试验
研究表明，将分离株E.coli和K.pneumoniae，分别接种LB液培养，作为攻毒菌。第1组腹腔注射E.coli，第2组腹腔注射K.pneumoniae，第3组腹腔注射生理盐水。1～4 h，所有小鼠正常；5 h时，第1、2组小鼠精神萎靡、运动减少，第3组无异常；8 h时，第1组小鼠精神萎靡、蜷缩、颤抖，第2组全部死亡，第3组无异常；26 h时，第1组全死亡，第3组无异常；10 d时，第3组无异常。E.coli和K.pneumoniae均为致病菌。
2.4 回收菌的分离培养及鉴定
研究表明，第1组回收菌E.coli形态与图2A形态一致，第2组回收菌K.pneumoniae形态与图2B形态一致。通过菌落PCR扩增两株回收菌16S rDNA基因，均得到大小约1 500 bp目的条带。E.coli的回收菌序列与攻毒菌序列一致性为100%，K.pneumoniae的回收菌序列与攻毒菌序列一致性为100%，分离株A、B与相对应的攻毒菌为同一菌株。图6
2.5 药敏试验
研究表明，E.coli和K.pneumoniae均对阿米卡星敏感，对其它16种抗生素耐药。表4
2.6 病毒与细菌混合感染情况
研究表明，14份粪便中，BCoV检出率为64.29%（9/14），BRV检出率为50.00%（7/14），未检测到BVDV、BEV和BNoV。4份肝组织中E.coli检出率为100.00%（4/4），K.pneumoniae检出率为50.00%（2/4）。3号牛存在BCoV和E.coli的混合感染，11号牛存在BCoV、BRV和E.coli的混合感染，13～14号牛存在BCoV、BRV、E.coli和K.pneumoniae的混合感染。表5
3 讨 论
3.1
犊牛腹泻是新生犊牛最重要的病症，感染率高、死亡率高、治愈率低［1，26-30］。
引起新疆地区犊牛腹泻最常见的病原为BVDV、BCoV、BRV、BEV、BNoV和E.coli［13-21］。从腹泻犊牛粪便提取病毒RNA，采用RT-PCR将扩增的阳性片段测序，经BLAST比对，确定试验样品中存在BCoV和BRV。对从肝组织分离的细菌通过菌落PCR，扩增了细菌16S rDNA序列，经BLAST比对、遗传进化分析和细菌生化特性试验，证明分离菌为E.coli和K.pneumoniae。2株菌为致病菌。
3.2
常继涛等［26］认为，症状严重、死亡率更高的犊牛腹泻，往往是由混合感染导致，病原微生物不断积累及病毒变异可使这种混合感染机率增加；当有BCoV混合感染时，病情更加严重，死亡率高达50% ～100%；同时BRV感染引起的肠细胞损伤更利于产毒素性E.coli 的附着和感染。试验检测到该牛场的病原为BCoV、BRV、E.coli和K.pneumoniae，存在病毒与细菌混合感染情况，其中4头牛为病毒与细菌混合感染而死亡，与上述研究结果相符。
3.3
对新疆犊牛腹泻的病原检测报道较多［13-21］，试验结果表明，其病原大多为病毒与细菌混合感染，其中病毒主要为BCoV、BRV 和BVDV，感染率范围分别为BCoV 9.54%～28.89%（77.59%冬季［19］）、BRV 0.90%～60.90%、BVDV 9.30%～24.60%；细菌大多为E.coli，因类别不同，耐药性存在差异。试验也检测到BCoV和BRV，其中BRV阳性率（50.00%）在感染率范围之内；BCoV阳性率（64.29%）接近最高感染率（77.59%冬季）。
3.4
喻华英等［21］认为，引起新疆犊牛腹泻的主要细菌病原为E.coli，吴静等［17］也检测到E.coli，试验检测结果与上述文献报道一致。王哲红［30］报道了新疆集约化牛场肺炎克雷伯氏菌的药敏试验结果，显示40株菌均对阿米卡星敏感，试验分离株K.pneumoniae也对阿米卡星敏感，与报道结果一致。试验分离的E.coli和K.pneumoniae对多种抗生素耐药。对分离的致病菌，后续可进行毒力基因、耐药性、耐药基因、致病与免疫逃避机制等深入研究。
4 结 论
引起犊牛腹泻的主要病原为BCoV、BRV、E.coli和K.pneumoniae，存在病毒与细菌的混合感染。分离出致病性E.coli和K.pneumoniae，2株菌均对阿米卡星敏感，对其它抗生素耐药，阿米卡星可作为防治E.coli和K.pneumoniae的首选药物。
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Etiological detection and identification of calf diarrhea
Abstract：【Objective】 This article aims to identify the main pathogens of calf diarrhea in a large-scale cattle farm in Xinjiang.
【Methods】" Virus detection was performed on 14 diarrhea calf feces using RT-PCR. Besides， bacteria were isolated from the liver tissues of four dead calves， cultured and identified， and mouse pathogenicity and drug sensitivity tests were conducted on these bacteria. Afterwards， the 16 S rDNA gene fragment of the isolated pathogenic bacteria was amplified and sequenced， and the sequencing results were searched for homologous sequences using BLAST in NCBI for genetic evolution analysis.
【Results】" The pathogens of diarrhea in the cattle farm were Bovine coronavirus （BCoV）， Bovine rotavirus （BRV）， Escherichia coli （E.coli）， and Klebsiella pneumoniae （K.pneumoniae）. Among the 14 feces， the detection rate of BCoV was 64.29%， and the detection rate of BRV was 50.00%; Among the four liver tissues， the detection rate of E. coli was 100.00%， and the detection rate of K.pneumoniae was 50.00%. The two isolated pathogenic bacteria E.coli and K. pneumoniae were sensitive to amikacin and resistant to all 16 other antibiotics.
【Conclusion】" The main pathogens causing calf diarrhea in this cattle farm are BCoV， BRV， E.coli， and K.pneumoniae， with mixed infection of viruses and bacteria. Amikacin can be used as the preferred drug for the prevention and treatment of E. coli and K. pneumoniae.
Key words：calf diarrhea; etiology; detection; identification
