摘 要：【目的】鉴定在新疆奎屯市（44°26′35″N，84°54′24″E）和阿拉尔市（40°32′30″N，81°17′35″E）的山桃腐烂枝条病症。
【方法】从山桃腐烂枝条上分离出2株山桃腐烂病病原菌（KTST和TDST），测定分析田间症状、无性形态、致病性，并结合ITS、RPB2、Tef1-α多基因序列联合鉴定分析病原菌。
【结果】KTST和TDST的子座结构、孔口的数量、腔室形状及孢子类型均符合壳囊孢属（Cytospora）特征，KTST与TDST分离株与GenBank中已有的Cytospora leucostoma、Cytospora chrysosperma菌株聚为一个独立的分支。将腐烂病病原菌接种在离体的健康山桃枝上，引起腐烂病症状，验证其致病性。
【结论】新疆奎屯市和阿拉尔市的山桃腐烂病致病菌为Cytospora chrysosperma。
关键词：山桃腐烂病；形态特征；致病性测定；多基因联合分析
中图分类号：S436.629"" 文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）12-3089-08
0 引 言
【研究意义】山桃树（ Prunus davidiana ）是一种小乔木或灌木，属于蔷薇科李亚科桃属，常被用于城市道路绿化的栽培树种［1-2］。山桃抗逆性强、成活率高、对环境适应力强，是退耕还林和改善土质的首选树种［3］，同时还是嫁接梅花和紫叶矮樱等树种的优秀砧木［4-5］。【前人研究进展】2010年Khalil-Berdi［6］在伊朗扁桃树上分离出3株腐烂病病原菌，鉴定为Cytospora cincta Sacc.和Cytospora leucosperma。Jane E.Stewart［7］对科罗拉多州西部的桃树腐烂病菌鉴定为Cytospora plurivora、Valsa parapersoonii和Leucocytospora Paraleucostoma。【本研究切入点】关于山桃树的文献报道多集中在良种砧木及抗寒耐旱品种上［8-10］，但山桃树病害鲜有报道。近年来，在新疆奎屯市和阿拉尔市山桃树上出现主干或侧枝干枯死亡，且病枝表皮上有黑色子实体。【拟解决的关键问题】在形态学观察基础上，结合分子系统学方法鉴定奎屯市和阿拉尔市的山桃腐烂病病原菌，为2市山桃腐烂病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
从新疆奎屯市和阿拉尔市采集具有典型病害特征的山桃腐烂病枝条，放入牛皮纸袋中，标记采集时间、地点带回实验室常温保存。表1
1.2 方 法
1.2.1 形态学观察
1.2.1.1 田间症状
观察病原菌在寄主植物上的为害症状、病斑颜色、大小，有无分生孢子角溢出及分生孢子角颜色。
1.2.1.2 病原菌的分离纯化及菌落培养性状
采用单孢分离法［11］分离山桃腐烂病病原菌，用75%的酒精消毒病组织表面，灭菌刀挑出子实体并切碎溶于无菌水中，制成孢子悬浮液（孢子悬浮液在显微镜下一个视野3～5个孢子）。取50 μL孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上，28°C暗培养1～2 d，挑取2块已萌发的菌丝转入新的PDA平板上，每个菌株重复3个培养皿，培养2～3 d后，用5 mm的打孔器取菌落边缘5 mm菌饼转接到新的PDA平板上中央进行菌株纯化，并用封口膜将培养皿封口，倒置于28°C恒温培养箱暗培养，观察记录菌落生长速度、菌丝纹饰质地、菌落后期是否产生色素和产孢情况。
1.2.1.3 子实体形态
在体式显微镜下观察病害标本子实体着生状态及孔口数量；徒手切片法［12］切取子实体横、纵切片各30个，观察横、纵切面的腔室数量、形态特征并测量大小，放大倍数后可观察到清晰的分生孢子梗，记录分生孢子梗颜色和分支情况；挑取病组织表面分生孢子角溶于无菌水稀释后镜检观察分生孢子形态及大小，无分生孢子角溢出的病样标本，可挑取子实体制成孢子悬浮液进行镜检观察，分生孢子各观察50个。
1.2.2 致病性
从田间采集1年生山桃健康枝条，将枝条截成10 cm的小段，用清水冲洗干净，将枝条浸泡在75%的酒精1 min，无菌水冲洗3遍后晾干表面水分。选取规格5 mm的打孔器在枝条正中间打孔［13］，再用5 mm灭菌打孔器在培养皿菌落边缘打取菌饼，用镊子将菌饼菌丝朝下接种到伤口处，每个菌株重复10 次，对照枝条接种空白PDA培养基。接种后的枝条用无菌保鲜膜将接种处缠紧，并用石蜡将枝条两端进行密封，放入接种盘置于28℃的光照培养箱内培养。接种后每24 h观察并测量病斑扩展速度、子实体形成和分生孢子角溢出时间。
1.2.3 分子生物学鉴定
1.2.3.1 基因组DNA的提取
用接种环从纯化培养皿内刮取少量菌丝转入100 mL PD培养基的锥形瓶中，置于25℃，180 r/min摇床内培养3～5 d，用无菌纱布过滤菌丝球，无菌水冲洗3遍，再用无菌滤纸干燥处理。将收集的干燥菌丝放入灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨。利用上海生物工程股份有限公司的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒方法，抽提山桃腐烂病病原菌基因组DNA。抽取的DNA溶液经1%琼脂糖凝胶电泳法检测后，于-20℃保存备用。
1.2.3.2 PCR扩增和测序
PCR采用12.5 μL体系：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mM each），上游引物和下游引物各0.5 μL（10 μM），0.15 μL Ex Tap 酶（5 U/mL），1 μL 的DNA模板，最后用ddH2O补足12.5 μL（TaKaRa）。参照PCR扩增引物序列［14-16］及反应条件。扩增后产物送至上海生工科技股份有限公司进行测序。表2
1.2.4 系统发育树的构建
将各个菌株的不同基因序列提交至NCBI中Blast程序中与Genbank中已知序列进行比对，下载同源性较高的序列，用MEGA X［17］进行多基因序列比对，用最大简约法［18］（Maximum Parsimony）构建序列的系统发育树。
2 结果与分析
2.1 形态学特征
2.1.1 分离株KTST形态
研究表明，KTST田间症状：发病部位多分布在侧枝上，个别枝条干枯死亡，在树皮上形成多而密集的黑色小突起，无分生孢子角溢出。
培养形态：在PDA培养基上初期白色到淡绿色，菌丝致密，放射状生长，菌落扩展速度为2.5 cm/d，第4 d菌丝生长覆盖全培养皿，菌丝产生墨绿色色素，培养5 d产生子实体，培养后期子实体溢出黄色油滴状分生孢子角。
子实体形态：子座在寄主树枝表皮下埋生，有明显的黑色界限圈，单孔口。腔室内褶形成规则的多腔室，共用腔室璧。横切面大小为1 045.16～1 553.91 μm×920.19～1 435.69 μm（平均1 367.68 μm×1 179.97 μm，n=30），纵切面大小为1 217.33～1722.74 μm×658.47～974.39 μm（平均1 534.52 μm×710.11μm，n=30）。分生孢子梗无色透明，不分枝。分生孢子无色透明，无分隔，腊肠形，大小为5.508～8.057 μm×0.855～1.570 μm（平均6.349 μm×1.135 μm，n=50）。图1
2.1.2 TDST形态特征
研究表明，TDST田间症状：发病的山桃树主干干枯死亡，病部溢出橘红色和橘黄色孢子角。
培养形态：病原菌培养24 h内开始生长，菌丝白色羽毛状，在接种中心呈放射状向四周生长，3 d后菌丝长满整个培养皿，菌落呈现白色，后期产生较浅的黄色色素，7 d后在培养皿生长出黑色球状的产孢器（子实体），15 d后小而密集的子实体随机分布在培养皿上。
子实体形态：子座在寄主表皮下埋生，无黑色界限圈，后期突出，呈圆锥形。腔室内褶形成复杂的多腔室，腔室数量7～26个，。腔室大小不一，各个腔室共用腔室壁，仅有一个孔口通向表皮外。子实体横切面大小为3 158.68～4 327.36 μm×1 852.93～3 859.45 μm（平均3 765.73 μm×2 963.12 μm，n=30），子实体纵切面大小为3 254.68～3 810.36 μm×744.32～1 357.67 μm（平均3 625.64 μm×1 187.67 μm，n=30）。分生孢子梗无色透明，不分枝。分生孢子单孢无色，腊肠形，大小为5.741～7.757 μm×1.536～2.334 μm （平均6.875 μm×1.903 μm，n=50）。图2
2.2 分离株KTST和TDST致病性变化
研究表明，将菌株KTST和TDST接种在1年生健康山桃枝条上，均可在48 h内发病，发病率均为100%，病斑呈褐色。TDST菌株病斑扩展速度为0.79 cm/d，较KTST菌株稍快。2株病原菌侵染后期在树皮上形成大量小突起，皱缩的树皮下出现黑色子实体。KTST和TDST致病力差异不明显。表3，图3
2.3 分子系统学
2.3.1 ITS 序列
研究表明，新疆奎屯市的山桃腐烂病分离株KTST与MG879495 、MH855047聚为一支，为Cytospora leucostom。来自阿拉尔市的分离株TDST与KX168605和KC880152聚为一支，同为Cytospora chrysosperm。图中KP045637作为外群基因。图4
2.3.2 RBP2序列分析
研究表明，分离株KTST与MW815958聚为一支，并与MH015295、MW815955、MN850746等Cytospora leucostom聚为一支，自展支持率均在95%以上KTST为C.leucostom。TDST与MH015303、KF76505、KF76506聚为一支，为壳囊孢属金黄壳囊孢菌Cytospora chrysosperm。TDST和KTST两个分离株则分布在较远的两支上。图5
2.3.3 TEF-1α 序列分析
研究表明，TDST与KF765722和KF765721聚为一支，自展支持率在98%以上，菌株KTST与MH820408和MW815944聚为一支，自展支持率达99%，因此TDST和KTST分别鉴定为C. chrysosperm、C.leucostom。图6
3 讨 论
3.1
Cytospora主要引起林木腐烂病，患病的树皮可能出现黄色、棕色、红褐色、灰色或黑色凹陷，在湿润条件下，分生孢子常以黄色、橙色到红色的胶状卷须的形式出现，寄主种类众多，地域分布广泛，寄主专一性弱，且不同寄主来源腐烂病之间存在交互侵染现象［19-20］，依靠传统形态学特征对其进行鉴定分类是不恰当的［21］。张星耀［22］、张俊娥［23］在对金黄壳囊孢菌表观特征研究时，发现不同分离株杨树腐烂病菌培养性状会由寄主及地理差异而出现明显分化现象。孙祥瑞［24］、冀瑞卿［25］对树皮腐烂病进行分子鉴定时发现单基因序列对腐烂病从类群到种的划分存在一定局限性，不同序列在同一个体内的差异可能超过了部分物种间的差异［26］，因此仅靠寄主、形态学特征或单基因系统发育研究对该类病原菌进行鉴定并不可靠。研究使用多基因联合分析，弥补了单基因结果的片面性，同时结合形态学分析得出种间差异，所得结果更加准确。
3.2
通过对山桃腐烂病病样上的子实体、菌落形态及致病性观察与测量。菌株TDST子座无黑色界限圈、顶盘单孔口、多腔室及培养形态初期白色，菌丝致密，培养后期淡黄色等特征均符合陆家元［27］对金黄壳囊孢的表述，也与范鑫磊［28］对壳囊孢属形态分类研究结果一致，但子实体大小及分生孢子大小略有不同，可能由于子实体成熟程度不同导致，也可能是由于金黄壳囊孢菌内部存在遗传分化。结合ITS、RPB2、TEF-1α三对基因分别测序建树，TDST总能与chrysosperma聚为一支，由此确定来自阿拉尔的山桃腐烂病菌株TDST为壳囊孢属金黄壳囊孢菌（C.chrysosperma）。同样菌株KTST子实体有明显的黑色界限圈，根据壳囊孢属形态学分类依据C.leucostom、Cytospora nivea、Cytospora cincta均有此特征，但C.leucostom孢子小于其他两个种，KTST孢子大小与C.leucostom一致，KTST菌落形态初期为白色至淡绿色，培养后期产生墨绿色色素，与马荣［29］对新疆壳囊孢属分类中C.leucostom描述一致，结合多基因序列比对，KTST为C.leucostom。TDST和KTST均是山桃腐烂病，但分为两个不同的种，一方面地理差异较大，另一方面可能来自其他寄主腐烂病菌的传播。根据致病性测定可知两个菌株均属于致病性菌株，是否侵染其他树种需进行进一步试验研究。
4 结 论
KTST和TDST的子座结构、孔口的数量、腔室形状及孢子类型均符合壳囊孢属（Cytospora）特征，KTST与TDST分离株与GenBank中已有的Cytospora leucostoma、Cytospora chrysosperma菌株聚为一个独立的分支。TDST和KTST分别为C.chrysosperma和C.leucostom。
参考文献（References）
［1］刘佳， 刘雅琴， 李靖， 等. 碱胁迫对山桃叶片形态结构及光合特性的影响［J］. 西南农业学报， 2017， 30（2）： 327-332.
LIU Jia， LIU Yaqin， LI Jing， et al. Effects of alkali stress on Prunus davidiana （carr.） leaf morphological structure and photosynthetic characteristics［J］. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2017， 30（2）： 327-332.
［2］ 安海军. 山桃在城市园林绿化中的应用［J］. 现代农村科技， 2021， （6）： 67-68， 44.
AN Haijun. The application of mountain peach in urban landscaping［J］. Modern Rural Science and Technology， 2021， （6）： 67-68， 44.
［3］ Xu D D， Li H Y， Lin L J， et al. Effects of carboxymethyl chitosan on the growth and nutrient uptake in Prunus davidiana seedlings［J］. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2020， 26（4）： 661-668.
［4］ 刘永刚. 山桃育苗及梅花嫁接培育技术［J］. 江西农业， 2019， （4）： 11-12.
LIU Yonggang. Cultivation Technology of mountain peach seedling and plum blossom grafting［J］. Jiangxi Agriculture， 2019， （4）： 11-12.
［5］ 程瑞春. 林木嫁接砧穗平衡理论及其应用［J］. 内蒙古林业调查设计， 2021， 44（1）： 14-17， 55.
CHENG Ruichun. The rootstock-scion balance theory and its application in tree grafting［J］. Inner Mongolia Forestry Investigation and Design， 2021， 44（1）： 14-17， 55.
［6］ Fotouhifar K B， Hedjaroude G A， Leuchtmann A. ITS rDNA phylogeny of Iranian strains of Cytospora and associated teleomorphs［J］. Mycologia， 2010， 102（6）： 1369-1382.
［7］ Stewart J E， Miller S T， Zink F A， et al. Genetic and phenotypic characterization of the fungal pathogen Cytospora plurivora from western Colorado peach orchards and the development of a ddPCR assay for detection and quantification［J］. Phytopathology， 2022， 112（4）： 917-928.
［8］ 杨跃文， 范明浩， 季蒙， 等. 干旱胁迫对5个种源山桃生长特性的影响研究［J］. 内蒙古林业科技， 2020， 46（4）： 33-36.
YANG Yuewen， FAN Minghao， JI Meng， et al. Effects of drought stress on growth characteristics of Prunus davidiana from five provenances［J］. Journal of Inner Mongolia Forestry Science and Technology， 2020， 46（4）： 33-36.
［9］ 尚建力. 山桃树种育苗造林技术分析［J］. 种子科技， 2020， 38（12）： 59， 62.
SHANG Jianli. Analysis of seedling cultivation and afforestation technology of mountain peach［J］. Seed Science amp; Technology， 2020， 38（12）： 59， 62.
［10］ 牛茹萱. 甘肃地方桃资源抗寒性评价及其对低温胁迫的响应机制［D］. 兰州： 甘肃农业大学， 2020.
NIU Ruxuan. Cold resistance evaluation and response mechanism of local peach resources to low temperature stress in Gansu ［D］. Lanzhou： Gansu Agricultural University，2020.
［11］ 方中达. 植病研究方法［M］. 3版. 北京： 中国农业出版社， 1998.
FANG Zhongda. Research methods of plant diseases［M］. Beijing： China Agriculture Press， 1998.
［12］ 唐俊煜， 王瑜， 李春艳， 等. 新疆南疆9种不同林果树木腐烂病菌无性形态比较［J］. 塔里木大学学报， 2015， 27（2）： 23-27.
TANG Junyu， WANG Yu， LI Chunyan， et al. Comparison of clonal morphology of rot pathogen from 9 kinds of trees in South Xinjiang［J］. Journal of Tarim University， 2015， 27（2）： 23-27.
［13］ 桂腾茸， 孔宝华， 马学林， 等. 云南苹果树腐烂病菌分离株生物学特性和致病性研究［J］. 西南农业学报， 2015， 28（5）： 2096-2102.
GUI Tengrong， KONG Baohua， MA Xuelin， et al. Studies on biological characters and pathogencity of isolates of Cytospora from apple tree in Yunnan［J］. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2015， 28（5）： 2096-2102.
［14］ 冯宝珍， 李培谦. 月季黑斑病病原菌鉴定及室内药剂初步筛选［J］. 植物保护学报， 2019， 46（5）： 1147-1154.
FENG Baozhen， LI Peiqian. Identification of the pathogen causing black spot of Chinese rose and fungicide screening for the disease control［J］. Journal of Plant Protection， 2019， 46（5）： 1147-1154.
［15］ Liu Y J， Whelen S， Hall B D. Phylogenetic relationships among ascomycetes： evidence from an RNA polymerse II subunit［J］. Molecular Biology and Evolution， 1999， 16（12）： 1799-1808.
［16］ Carbone I， Kohn L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes［J］. Mycologia， 1999， 91（3）： 553-556.
［17］ Kumar S， Stecher G， Li M， et al. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms［J］. Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）： 1547-1549.
［18］ Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies： an approach using the bootstrap［J］. Evolution， 1985， 39（4）： 783-791.
［19］ Fan X L， Bezerra J D P， Tian C M， et al. Cytospora （diaporthales） in China［J］. Persoonia， 2020， 45： 1-45.
［20］ 郭众仲， 张王斌， 李亚鹏， 等. 不同寄主来源腐烂病菌对库尔勒香梨树致病性研究［J］. 新疆农业科学， 2014， 51（12）： 2245-2250.
GUO Zhongzhong， ZHANG Wangbin， LI Yapeng， et al. Study on the Pathogenicity of Canker Pathogen from Different Hosts to Korla fragrant pear Tree［J］. Xinjiang Agricultural Sciences， 2014， 51（12）： 2245-2250.
［21］ 李春艳， 张王斌， 苟巧， 等. 不同寄主来源腐烂病菌对枣树致病性研究［J］. 新疆农业科学， 2016， 53（1）： 51-58.
LI Chunyan， ZHANG Wangbin， GOU Qiao， et al. Study on the pathogenicity of Cytospora spp. from different hosts to jujube［J］. Xinjiang Agricultural Sciences， 2016， 53（1）： 51-58.
［22］ 张星耀， 陈海燕， 梁军， 等. 金黄壳囊孢菌（Cytospora chrysosperma）的培养性状和营养体亲和性［J］. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2007， 35（3）： 99-105.
ZHANG Xingyao， CHEN Haiyan， LIANG Jun， et al. Cultural morphology and vegetative compatibility of Cytospora chrysosperma isolates［J］. Journal of Northwest A amp; F University （Natural Science Edition）， 2007， 35（3）： 99-105.
［23］ 张俊娥， 范鑫磊， 梁英梅， 等. 杨树腐烂病菌表观特征及遗传多样性分析［J］. 北京林业大学学报， 2017， 39（7）： 76-86.
ZHANG June， FAN Xinlei， LIANG Yingmei， et al. Analysis of appearance features and genetic diversity of Cytospora chrysosperma causing poplar canker［J］. Journal of Beijing Forestry University， 2017， 39（7）： 76-86.
［24］ 孙祥瑞， 朱杰华， 刘蕊， 等. 几种树皮腐烂病菌的分子鉴定［J］. 河北农业大学学报， 2010， 33（6）： 36-42.
SUN Xiangrui， ZHU Jiehua， LIU Rui， et al. Molecular identification of pathogens of several trees canker［J］. Journal of Agricultural University of Hebei， 2010， 33（6）： 36-42.
［25］ 冀瑞卿， 李玉， 宋瑞清， 等. 金黄壳囊孢菌rDNA ITS序列测定及生理学特性［J］. 吉林农业大学学报， 2010， 32（5）： 483-487.
JI Ruiqing， LI Yu， SONG Ruiqing， et al. Cultural characteristics and rDNA its sequence analysis of Cytospora chrysosperma［J］. Journal of Jilin Agricultural University， 2010， 32（5）： 483-487.
［26］"""" HAN Yuli， WANG Di， ZHOU Jie， et al. Intragenomic polymorphisms of the ITS， EF1-α and RPB2 sequences of Ganoderma australe［J］. Mycosystema， 2019， 38（5）： 679-685.
［27］ 陆家云. 植物病原真菌学［M］. 北京： 中国农业出版社， 2001.
LU Jiayun. Plant pathogeny mycology［M］. Beijing： China Agriculture Press， 2001.
［28］ 范鑫磊. 中国黄河流域壳囊孢属的分类和系统学研究［D］. 北京： 北京林业大学， 2016.
FAN Xinlei. Taxonomy and systematics of the genus Cytospora in the Yellow River Basin of China［D］. Beijing： Beijing Forestry University， 2016.
［29］ 马荣. 新疆壳囊孢属真菌的分类及系统学研究［D］. 北京： 北京林业大学， 2017.
MA Rong. Study on taxonomy and systematics of the fungi of the genus Cystispora in Xinjiang［D］. Beijing： Beijing Forestry University， 2017.
Identification of the pathogen of Prunus davidiana canker in Xinjiang
TANG Li1， LI Chunyan2， JIA Wenhao1， LIU Zhenya1， LI Yapeng1， DAN Hongxia1， ZHANG Wangbin1
（1. The National Local Joint Engineering Lab of High Efficiency and Superior-Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Tress in Southern Xinjiang/Key Lab of Xinjiang Production and Construction Corps in Comprehensive Agricultural Pest Management in Southern Xinjiang/Scientific Observing/Experimental Station of Crops Pests in Aral， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Tarim University， Aral Xinjiang 843300， China; 2. Xinjiang Applied Vocational and Technical College， Kuitun Xinjiang 833200， China）
Abstract：【Objective】 There is a typical symptom about canker disease in Prunus davidiana from Kuitun City （44°26′35″N， 84°54′24″ E） and Aral City （40°32′30″N， 81°17′35″E）， Xinjiang.With this in mind， this research aim to identify the real cause.
【Methods】"" Pathogens （KTST and TDST） were isolated from the susceptible Prunus davidiana branches.
【Results】" Based on morphological characteristics， combined with ITS， RPB2 and Tef1-α multi-genesequence analysis， Cytospora leucostoma and Cytospora chrysosperma were isolates from KTST and TDST.
【Conclusion】" The Koch postulates was verified by inoculating the pathogen of canker disease on the healthy branches in vitro to cause canker disease symptoms.
Key words： Valsa canker; morphological characteristics; pathogenicity determination; multigene analysis
Fund project：Genetic Diversity and Pathogenicity Differentiation of Fruit Trees in Xinjiang （31660034）
Correspondence author： ZHANG Wangbin（1974-），male，from Cheng cheng，professor，masters supervisor，research direction：plant pathology，（E-mail）zwbzky@163.com
基金项目：“新疆枣园林果树木腐烂病菌遗传多样性及致病力分化研究”（31660034）
作者简介：唐丽（1993-），女，四川德阳人，硕士研究生，研究方向为植物病理学，（E-mail）susuzaizai@163.com
通讯作者：张王斌（1974-），男，陕西澄城人，教授，硕士生导师，研究方向为植物病理学，（E-mail）zwbzky@163.com
