摘 要：从香野草莓发病根茎部分离得到枯萎病菌株，经鉴定属于尖孢镰刀菌。采用生长速率法测定13种杀菌剂对该菌株的室内毒力。结果表明，咪鲜胺和叶菌唑对草莓枯萎病病原菌的抑制活性最高，EC50值分别为0.051 mg/L和0.060 mg/L。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC50值分别为0.304 mg/L和0.382 mg/L。氟环唑、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、己唑醇、嘧菌酯、啶酰菌胺、肟菌酯、腈菌唑和氟吡菌胺对其EC50值分别为0.535 mg/L、0.622 mg/L、0.725 mg/L、1.206 mg/L、1.239 mg/L、1.378 mg/L、1.462 mg/L、1.651 mg/L和2.024 mg/L。上述药剂均可作为草莓生产中防控枯萎病的高效药剂。
关键词：草莓；枯萎病；尖孢镰刀菌；室内毒力
中图分类号： S668.4 文献标识码： A
文章编号： 1002-2910（2024）04-0016-05
收稿日期：2024-04-15
基金项目：山东省重点研发计划（2023TZXD057、2022CXPT017）；中央引导地方科技发展专项（YDZX2023031）。
*通信作者：武冲（1983-），男，山东泰安人，副研究员，从事草莓育种与栽培研究。E-mail： wuchongge@163.com
作者简介：张荣（1984-），女，山东泰安人，高级工程师，从事草莓植保研究。E-mail： zrzw5251@163.com
Pathogen isolation of strawberry wilt and the indoor toxicity of 13 fungicides
ZHANG Rong1， JIANG Lili2， JIANG Wenpeng3， WANG Fengchao4， WU Chong2*
（1.Taian Daiyue District Forestry Protection and Development Center， Taian，Shandong 271000， China;2.Shandong Institute of Pomology/Shandong Technology Innovation Center of Modern Protected Fruit Trees， Taian，Shandong 271000， China; 3.Yantai Shuntai Plant Protection Technology Co. LTD， Yantai， Shandong 265509， China; 4.Plant Protection College， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China）
Abstract：In this study， a pathogenic strain of Fusarium oxysporum was isolated from the diseased rhizome of strawberry wilt. Growth rate method was used to determine the indoor toxicity of 13 fungicides against this strain. The results showed that prochloraz and metconazole had the highest inhibitory activities against Fusarium wilt， with EC50 values of 0.051 mg/L and 0.060 mg/L， respectively. Flusiazole and prothioconazole followed， with EC50 values 0.304 mg/L and 0.382 mg/L， respectively. The EC50 values of epoxiconazole， pyraclostrobin， difenoconazole， hexaconazole， azoxystrobin， boscalid， trifloxystrobin， myclobutanil and fluopicolide against F. oxysporum were 0.535 mg/L， 0.622 mg/L， 0.725 mg/L， 1.206 mg/L， 1.239 mg/L， 1.378 mg/L， 1.462 mg/L， 1.651 mg/L and 2.024 mg/L， respectively. All the above agents could be used as effective agents to control Fusarium wilt in strawberry production.
Key words：strawberry; wilt; Fusarium oxysporum; indoor toxicity
中国已成为世界第一草莓生产和消费大国，栽培面积和产量增幅名列前茅［1］。目前中国草莓以设施栽培为主，环境相对封闭。加之常年连作、有机肥料施用不足，导致土壤微生态环境恶化，土传性病害日趋严重［2］。有报道称，草莓在连作区域种植，土传病害的发生率高达55.0%～91.6%［3］。草莓枯萎病主要侵染草莓根部，堵塞木质部，引起木质部褐化、根系坏死，植株枯死，在草莓育苗期和生产期均可发生［4］，病原菌在0～20 cm土层内的密度最高，其休眠孢子可在土壤中存活数年。
山东省草莓年栽培面积3.6万hm2（54万亩），位居全国首位［5］。近年来因枯萎病造成的减产现象频发。笔者以山东省潍坊市草莓主产区发生的枯萎病为研究对象，进行病原菌的分离、鉴定，通过室内毒力试验筛选高效防治药剂，为草莓枯萎病的科学防控提供技术支撑，保障草莓产业健康发展。
1 材料与方法
1.1 供试药剂
供试原药13种：95%丙硫菌唑（山东海利尔化工有限公司）；97%氟环唑、96%啶酰菌胺、96%叶菌唑、95%己唑醇、95%氟硅唑（山东潍坊润丰化工股份有限公司）；97%咪鲜胺（山东华阳农药化工集团有限公司）；97%氟吡菌胺（德州绿霸精细化工有限公司）；98%吡唑醚菌酯、97%苯醚甲环唑、98%腈菌唑、98%肟菌酯（山东省联合农药工业有限公司）；98%嘧菌酯（山东京博农化科技股份有限公司）。
1.2 草莓枯萎病病原菌分离
从山东省潍坊市寿光市草莓基地采集香野草莓的枯萎病株，以灭菌湿报纸保湿带回实验室备用。
将病株以流水冲洗干净，用吸水纸吸干水分后放于超净工作台上，以灭菌刀片切取病健交界组织，用2%次氯酸钠溶液消毒10 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，接种于PDA培养基平板中央，25 ℃黑暗培养3～4 d。待菌落长成后，观察形态特征，从数量最大的菌落边缘挑取菌丝重新接种于新的PDA平板中央进一步分离纯化。
根据柯赫氏法则［6］，将纯化得到菌株制备直径7 mm的菌饼，回接到香野草莓幼苗茎基部，常规栽培管理，观察回接幼苗的发病症状与原症状是否一致。
1.3 病原菌鉴定
采用CTAB法提取菌丝基因组DNA，以ITS序列通用引物（ITS1/ITS4）进行PCR扩增。扩增产物经回收、纯化后，连接载体并转化、克隆、测序。将测得的序列与NCBI数据库进行BLAST比对后，构建系统发育树。
1.4 室内药剂毒力测定
1.4.1 药剂配制 将供试的13种原药中，95%氟硅唑原药以环己酮配制1%母液外，其余原药均以丙酮配制1%的母液，于4 ℃保存备用。根据预试验的数据调整试验浓度，确定各供试原药的5个配制浓度（表1）。
1.4.2 药剂毒力试验 采用菌丝生长速率法［6］，在超净工作台上，以无菌水对供试药剂原液进行梯度稀释。分别移取1 mL各浓度药液，加入49 mL灭菌冷却至50～60 ℃的PDA培养基中，充分混匀后制备3个含药PDA平板。平板凝固后，以内径7 mm的灭菌打孔器，从活化好的草莓枯萎病菌菌落边缘打取菌饼，接种于含药PDA平板中央，以灭菌水代替药液为对照。25 ℃黑暗培养，待对照组菌落长至培养皿2/3左右时，以十字交叉法［7］测定各处理的菌落直径。计算各浓度药液处理的抑制率。
抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100
1.4.3数据处理 采用SPSS 18.0软件，将抑制率转换成概率值，以药剂浓度对数值为横坐标、抑制率概率值为纵坐标，计算线性回归方程和相关系数。根据回归方程计算抑制中浓度（EC50）值和95%置信限［8］。以活性最低药剂的EC50值为基准值，计算其他药剂的相对毒力指数。
2 结果与分析
2.1 草莓枯萎病病原菌分离
通过分离培养得到菌落11个，根据形态合并为3类，数量分别为7个、3个和1个。将其中数量最大的菌株进行纯化，纯化后如图1所示，菌落圆形，整体生长速度较慢，菌丝浅紫色，较密实，呈棉絮状，培养后期可见白色孢子囊。菌落背面有紫色同心圆，与刘植鑫等［9］报道的草莓枯萎病病原菌生物学特征一致。
将分离得到的草莓枯萎病菌株菌饼回接至草莓幼苗茎基部，10 d后发病症状与原枯萎病症状一致。
2.2 病原菌鉴定
对分离得到的草莓枯萎病菌株进行ITS测序得到1段长度517 bp的序列，通过BLAST比对发现，与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）相似度为100%。进一步构建系统发育树发现，该菌株与尖孢镰刀菌的亲缘关系最近（图2），结合形态学特征，将其鉴定为尖孢镰刀菌。
2.3 13种杀菌剂对草莓枯萎病菌菌丝生长的抑制率
由表2可知，4种药剂对草莓枯萎病的抑制活性高：咪鲜胺和叶菌唑在浓度为0.025～0.500 mg/L时，抑制率为33.56%～93.61%和29.30%～92.17%；氟硅唑和丙硫菌唑，浓度为0.100～2.500 mg/L时，抑制率分别为27.73%～88.85%和23.73%～87.23%；氟环唑、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑在浓度为0.250～5.000 mg/L时，抑制率分别为31.68%～93.42%、27.23%～91.36%和22.85%～88.73%；另9种药剂对草莓枯萎病的抑制活性较低：己唑醇在浓度为0.500～10.000 mg/L时的抑制率为29.99%～89.92%，与此同样浓度梯度下，嘧菌酯的抑制率为31.74%～88.35%，啶酰菌胺的抑制率为27.23%～89.73%，肟菌酯的抑制率为29.18%～84.16%，腈菌唑的抑制率为23.73%～87.16%，氟吡菌胺的抑制率为20.22%～85.03%。
2.4 13种杀菌剂对草莓枯萎病菌的室内毒力
由表3可知，供试13种杀菌剂对草莓枯萎病菌均表现出较高的室内毒力。其中，氟吡菌胺的最低，抑制中浓度EC50值为2.024 mg/L。以此EC50值为基准值，计算其他药剂的相对毒力指数。咪鲜胺和叶菌唑对草莓枯萎病菌菌丝生长的室内毒力最高，EC50值分别为0.051 mg/L和0.060 mg/L，相对毒力指数分别为39.69和33.73。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC50值分别为0.304 mg/L和0.382 mg/L，相对毒力指数分别为6.66和5.30。氟环唑、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑的对草莓枯萎病菌的室内毒力也较高，EC50值分别为0.535 mg/L、0.622 mg/L和 0.725 mg/L，相对毒力指数分别为3.78、3.25和2.79。己唑醇、嘧菌酯、啶酰菌胺、肟菌酯和腈菌唑的EC50值分别为1.206 mg/L、1.239 mg/L、1.378 mg/L、1.462 mg/L和1.651 mg/L，相对毒力指数分别为1.68、1.63、1.47、1.38和1.23。
3 小结与讨论
在潍坊市草莓主产区分离得到1株草莓枯萎病致病菌，经形态学和分子生物学鉴定，确认是尖孢镰刀菌。此菌可以以厚垣孢子或分生孢子的形式在病残体上或土壤中休眠、越冬。条件适宜时，孢子萌发，从草莓根部伤口或根尖处侵入，在维管束内增殖，分泌毒素，堵塞植株输导组织，导致植株水分供应不足，蒸腾作用受阻，引起萎蔫死亡［10］。 由于病菌侵染部位较为隐蔽，潜伏期较长，对草莓枯萎病的防治需以预防为主。《中国农药信息网》显示，登记用于草莓枯萎病的药剂产品仅7个，且以木霉菌、枯草芽孢杆菌等生防菌剂为主，缺乏高活性杀菌剂。
本研究对13种杀菌剂原药通过室内毒力测定发现，咪鲜胺和叶菌唑对草莓枯萎病菌的室内毒力最高，EC50值分别为0.051 mg/L和0.060 mg/L，相较于氟吡菌胺的相对毒力倍数分别为39.69和33.73。氟硅唑和丙硫菌唑次之，EC50值分别为0.304 mg/L和0.382 mg/L。上述药剂均可作为草莓生产中防控枯萎病的高效药剂。
咪鲜胺属于咪唑类杀菌剂，通过抑制真菌体内麦角甾醇合成、破坏菌体细胞膜功能而达到杀菌作用，是防治瓜果蔬菜的炭疽病、根腐病等高效药剂［11］。严蕾艳［12］等报道，咪鲜胺对引起瓜类根腐病的多种镰刀菌菌丝生长均表现出较高的抑制作用，平均EC50值0.135 mg/L。蔺秀婷［13］等报道了一种引起甜瓜枯萎病的新致病菌—拟轮枝镰刀菌，室内毒力测定发现，咪鲜胺和氟硅唑对其抑制活性高，EC50值分别为0.0295 μg/mL和0.1901 μg/mL。
叶菌唑是日本吴羽化学工业公司在对三唑类杀菌剂结构剖析的基础上，通过定量构效关系合成的高性能三唑类杀菌剂，对镰刀菌引起的病害具有极高活性［14］，杀菌谱广、有内吸性，兼具保护和治疗作用，目前主要登记用于谷类作物病害防治，尚未在草莓上获得登记。赫丹等［15］报道，叶菌唑对玉米穗腐病致病菌—轮枝镰刀菌的抑制活性较高，菌丝生长EC50值在0.005～0.029 μg/mL之间。
氟硅唑属于三唑类杀菌剂，对子囊菌、担子菌及部分半知菌引起的病害防治高效［16］。田凤鸣［17］等报道，氟硅唑对花椒根腐病病原菌—茄腐镰孢菌的室内毒力较高，EC50值为2.08 mg/L。
丙硫菌唑是拜耳公司开发的新型三唑硫酮类杀菌剂，通过抑制真菌体内甾醇前体羊毛甾醇脱甲基化而起到杀菌作用，杀菌谱广，对多种作物土传和叶部病害高效［18］。项丹丹［19］等报道，丙硫菌唑对引起香蕉枯萎病的病原菌—尖孢镰刀菌古巴专化型具有较高的抑制活性，EC50值为0.79 μg/mL。
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