DOI：" 10.13855/j.cnki.lygs.2024.05.004
摘" 要：本研究利用small RNA高通量测序在甜樱桃中发现了与乙型线性病毒科柑橘病毒属的柑橘叶疱斑病毒具有较高同源性一种病毒。对该病毒进行全基因组克隆，分析发现，该病毒在核苷酸水平上与柑橘叶疱斑病毒的同源性为80%；该病毒的外壳蛋白基因序列与柑橘叶疱斑病毒的外壳蛋白基因序列进行同源性比较，在核苷酸水平上，同源性为79%，在氨基酸水平上，同源性为88%。根据该科病毒新种的划分标准，认为该病毒为柑橘叶疱斑病的一个新株系，将其命名为柑橘叶疱斑病毒樱桃株系。
关键词：柑橘叶疱斑病毒CLBV；small RNA高通量测序；同源性分析
中图分类号：" S662.5" 文献标识码：" A
文章编号：" 1002-2910（2024）05-0016-04
收稿日期：2024-08-06
基金项目：山东省自然科学基金面上项目（ZR2021MC117）；烟台市大樱桃育种联合攻关团队创建项目；山东省重点研发计划项目 （ 2022TZXD006） 。
*通信作者：王甲威（1981-） ，男，山东聊城人，副研究员，从事果树种质资源与遗传育种研究工作。E-mail：wangjw-sdip@qq.com
作者简介：王刚（1994-），男，山东聊城人，研究实习员，从事果树种质资源与遗传育种研究工作。E-mail：1468055441@qq.com
Whole genome cloning and preliminary identification of CLBV strain in Prunus
WANG Gang， QIAO Qian， ZHU Dongzi， LIU Qingzhong， WANG Jiawei*
（Shandong Institute of Pomology/ Ministry of Agriculture Huanghuai area Pomology Science Observation Experimental Station， Taian， Shandong 27100，China）
Abstract：In this study， small RNA high-throughput sequencing was used to identify a virus with high homology to the citrus leaf blister virus（CLBV） of the genus beta-linear virus in sweet cherry. The whole genome of the virus was cloned， and it was found that the virus had 80% homology with CLBV at nucleotide level; the sequence homology of the coat protein gene of this virus was compared with that of CLBV. The homology was 79% at the nucleotide level and 88% at the amino acid level. According to the classification criteria， this virus was considered a new strain of CLBV， and named Citrus Leaf Blotch virus Strain Prunus.
Key words：citrus leaf blister spot virus CLBV; small RNA high-throughput sequencing; homology analysis
柑橘叶疱斑病毒（CLBV）是属于β线性病毒科（Beta flexiviridae）柑橘病毒属（Citrivirus）的正义单链RNA病毒［1］。在美国加利福尼亚州首次发现该病毒，可引起橘橙叶片出现疱斑，并命名为橘橙叶疱斑病毒（Dweet mottle virus，DMV），随后在西班牙采用嫁接鉴定技术研究发现金橘（Fortunel la margarita）感染CLBV［2］。进一步研究确认DMV和CLBV为同种病毒的不同分离物。在自然条件下，CLBV主要侵染柑橘属（Citrus L.）和猕猴桃属（Actinidia L.）植物，最近采用深度测序技术在中国樱桃上首次检测到该病毒［3］。该病毒主要通过嫁接传播，具有较低的种传能力，不能被昆虫传播。在猕猴桃上发现一种病毒（M3-A，JN900477）与CLBV具有较高的同源性，但因其序列的复杂性很难确定其为CLBV的一个新株系或是该属病毒的一个新种，在此将其暂定为CLBV的新株系［4］。CLBV在世界上分布范围较广，包括西班牙、法国、意大利、日本、澳大利亚、新西兰、美国，对柑橘生产造成了较大危害［5-7］。笔者介绍了柑橘叶疱斑病毒樱桃株系（CLBV strain Prunus）的全基因组克隆方法及初步分析鉴定［8-10］。
1" 材料与方法
1.1" 试验材料
试验所用的柑橘叶疱斑病毒感染的樱桃枝条样本取材于山东省果树研究所泰东试验基地，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2" 试验设计
1.2.1 柑橘叶疱斑病毒樱桃株系的全基因组克隆
引物设计。根据small RNA的分析结果，设计了3对引物，进行CLBV strain Prunus基因组序列的扩增，引物序列见下表1。
基因组序列扩增。以甜樱桃CLBV感染枝条样品的反转录产物为模板，进行CLBV strain Prunus的基因组序列扩增。
1.2.2 目的片段回收克隆及测序
目的片段回收与连接。将PCR产物电泳后的目的条带进行切胶回收，切胶试剂盒为快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，将回收产物进行连接，所用连接试剂盒为pEASY-T1 Simple Cloning Kit。
阳性克隆的PCR鉴定及测序结果分析。用PCR方法鉴定阳性克隆，取1 μL菌水混合液于25 μL PCR体系中，用M13 Forward Primer 和M13 Reverse Primer 鉴定阳性克隆，每个产物挑选5个克隆进行测序。测序完成后，去除克隆载体序列，进行测序结果的拼接，得到CLBV strain Prunus基因组的序列。
1.2.3 扩增CLBV strain Prunus基因组的5端序列
根据CLBV strain Prunus基因组序列的测序结果设计5RACE的引物，进行CLBV strain Prunus基因组5端序列的扩增，引物序列见表2。
1.2.4 扩增CLBV strain Prunus基因组的3端序列
根据CLBV strain Prunus基因组序列的测序结果设计3RACE的引物，进行CLBV strain Prunus基因组3端序列的扩增，引物序列见表3。
1.2.5 CLBV strain Prunus全基因组序列拼接
通过基因组序列的克隆、3RACE及5RACE的测序结果，可以拼接得到CLBV strain Prunus基因组的全序列。
2" 结果与分析
2.1" 基因组序列扩增结果
甜樱桃CLBV感染枝条样品进行CLBV strain Prunus的基因组序列扩增，电泳结果见图1，从图中可以看到，3对引物都扩增得到了目的条带。
2.2" CLBV strain Prunus全基因组序列拼接结果
经过拼接得到了CLBV strain Prunus基因组的全序列，基因组全长8 672 nt，包含68 nt的5UTR和528 nt的3UTR。
2.3" 甜樱桃CLBV 中sRNA测序读数的总体分析
甜樱桃CLBV 样品通过HiSeq2000高通量测序平台进行small RNA测序，测序策略为单端50 nt，得到的原始读数约1500万，去除接头、低质量数据和序列长度小于18 nt的读数后序列总长度为345 940 499 nt，具有很好的深度和一致性，可进行分析比较（表4）。
2.4" 甜樱桃CLBV 中的sRNAs不同长度分析
将甜樱桃CLBV 样品中来源于CLBV strain Prunus的sRNAs根据长度进行分类，发现来源于病毒的sRNAs以21 nt和22 nt大小为主（图2）。
2.5" 甜樱桃CLBV的同源性分析及初步鉴定
2.5.1 CLBV strain Prunus的基因组同源性分析
将CLBV strain Prunus基因组全序列在NCBI上进行Blast分析，我们得到了与CLBV strain Prunus同源性较高的病毒序列。通过分析发现在GenBank上共注册了4个CLBV病毒的基因组全序列，分别为AJ318061、EU857539、EU857540和FJ009367，以及暂定为CLBV新株系的JN900477、JN983454、JN983455和JN983456，其中AJ318061被选为CLBV病毒的参考序列（NC_003877）。从序列长度上分析，CLBV strain Prunus与这8个CLBV株系的序列长度不同，其中NC_003877、EU857539、EU857540和FJ009367序列长度均为8 747 nt， JN900477、JN983454、JN983455和JN983456序列长度均为8 782 nt，而CLBV strain Prunus序列长度为8 762 nt。将CLBV strain Prunus基因组全序列与这8个CLBV株系进行了序列比对，发现其相似性与第1组为80%，与第2组为75%。进一步的分析发现，这9个CLBV株系的基因组结构仍然分为3组（表5）。CLBV strain Prunus基因组编码了3个ORF，其中，ORF1编码了一个229 kDa融合蛋白，包括甲基转移酶（methyltransferase ）、解旋酶（helicase）和RNA复制酶基因（RNA-dependent RNA polymerase）；ORF2编码了一个40 kDa蛋白，推测为移动蛋白（Movement Protein）； ORF3编码了一个40.2 kDa的蛋白，推测为外壳蛋白（coat protein）。
2.5.2 CLBV strain Prunus株系种属关系的初步鉴定
为分析CLBV strain Prunus与甲型、乙型、丙型病毒科其他成员的亲缘关系，选取这3个科其他属病毒的外壳蛋白基因的的氨基酸序列，进行了进化关系分析，采用MEGA6.0软件，选择最大似然法（Maximum Likelihood，bootstrap replicates out of the 1000 replicates）进行进化关系分析，进化关系如图3。从图上可以看出，CLBV strain Prunus与CLBV、CLBV strain Actinidia具有较近的亲缘关系，在同一个进化分支，与该科其他病毒亲缘关系较远［11］。
2.5.3 CLBV与其他CLBV株系的同源性分析
为了进一步分析CLBV strain Prunus与其他CLBV株系的亲缘关系，将在GenBank注册的所有CLBV的序列进行了同源性分析。从图4上可以看出，CLBV strain Prunus与CLBV其他株系的亲缘关系较远，说明CLBV strain Prunus为一个新株系，这一株系可能仅在樱桃上，能否侵染柑橘或猕猴桃尚需进一步研究。
3" 小结
根据CLBV strain Prunus测序的结果，得到了CLBV strain Prunus的全基因组序列。通过分析发现来自于CLBV strain Prunus的small RNA主要为21 nt和22 nt，这与其他植物病毒来源的small RNA相同，说明在樱桃可能与其他植物具有相同的病毒防御机制。通过进化树分析，进一步确认了CLBV strain Prunus株系的种属地位，并根据外壳蛋白基因的氨基酸序列同源性分析结果，结合该科病毒的种的分类标准确认其为CLBV的一个新株系。
参考文献：
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