中图分类号：S482.2 文献标志码：A 文章编号：1002-2910（2025）02-0043-05
Research progress on RNA fungicides
CHEN Min1， ZHANG Wei1，LI Lili²， LIU Weiyun³， LI Ning4，LIU Baoyou1*
（1.Yantai Academy of Agricultural Sciences， Yantai，Shandong 2655oo， China; 2.Shandong Academy of Agricultural Sciences，JinanShandong 250131， China; 3.Shandong InstituteofPomology，Taian，Shandong 271000， China; 4.Qingdao Kangqiao Biotechnology Co. Ltd， Qingdao，Shandong ， China）
Abstract： RNA fungicides use RNA interference technology to inhibit or kill crop pathogenic bacteria by suppressing the expression of important functional genes. These fungicides have strong targeting and environmentally friendly characteristics， which are beneficial for green and precise prevention and control of crop diseases. The mechanism of RNA interference， dsRNA synthesis technology， research and development of RNA fungicides and their application in disease prevention and control were summarized. And the existing problems of RNA fungicides were analyzed， prospect for their future development trends was presented.
Key words： RNA fungicides; RNA interference; crop diseases; research progress
作物病害的发生给农业生产造成严重的经济损失，目前对农作物病害的防控主要是采取化学农药防控，但化学农药过量使用导致病害抗药性增强、农药残留超标、生物多样性降低和环境污染等负面问题[1]，导致防治成本提高，还严重影响农产品品质和人体健康。据统计，“十三五”期间全国种植业农药使用量年均27.03万t，比“十二五”期间降低了 
，农药品种的持续优化和新型高效环保农药的研发使用，为持续降低农药使用量发挥了重要作用。生物农药是推进作物病虫害绿色防控的重要农业投入品，目前常用的生物农药主要有植物源农药（如苦参碱、蛇床子素、印楝素等）、动物源农药（如黄蜂毒素、沙蚕毒素等）、微生物源农药（如苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌等）。随着分子生物学研究的不断深人和RNA十扰前沿技术的发展，RNA生物农药有望成为作物病害防控领域的重要工具。RNA生物农药是“第三次农药革命”的重要产品，其具有较高的特异性和环境安全性，在防治农作物病害中有巨大潜力[。笔者对RNA杀菌剂的研究进展进行综述，旨在加深农药研究者、生产者和使用者对RNA杀菌剂的认识，为RNA杀菌剂新产品的研发和农作物病害的绿色防控提供参考。
1 RNA干扰的作用机制
RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指在生物进化过程中高度保守的，由双链RNA（Double-strandedRNA，dsRNA）诱发的，导致信使RNA（MessengerRNA，mRNA）功能丧失的现象，根据抑制的类型不同，分为转录水平上的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）和转录后的基因沉默（Post-trans-criptional gene silencing，PTGS），两种类型分别通过抑制转录前水平或转录后水平的基因表达，而诱导表型的缺失或者导致生物体死亡[4]。RNA杀菌剂是一种可以特异性结合靶标病菌中的同源mRNA，沉默相应基因的表达，从而干扰靶标生物的正常生长，导致病原菌死亡[5]，实现对作物病害的绿色防控。
2 dsRNA合成技术
目前用于dsRNA合成的方法主要有3种，分别为化学合成法、RNA聚合酶体外合成法和微生物发酵扩繁dsRNA法[。化学合成法是通过组装核糖核苷酸合成两条互补的单链RNA，并使这些互补的单链RNA退火形成dsRNA，然而这种方法存在合成周期长，dsRNA长度受限，合成成本高等问题[7]，主要适用于实验室小规模的基因功能研究；RNA聚合酶体外合成法利用RNA聚合酶和cDNA反转录技术，在体外合成并纯化获得dsRNA，所得dsRNA具有稳定性强，纯度高等优点[8]，但也存在合成过程复杂和成本高的问题，不适合大规模、低成本的工业化生产；微生物发酵扩繁dsRNA法是构建微生物工厂，利用微生物体内转录机制合成dsRNA，并借助微生物的快速发酵能力实现dsRNA的大规模生产。这种方法具有操作简便、成本低、稳定性好等优势，是目前dsRNA大规模生产最有效的方法之一[9]。因此，为实现dsRNA在生产实践和农业领域应用，利用微生物发酵获得dsRNA已成为研究热点。Timmons等发现一种RNAⅢ型酶缺陷型的大肠杆菌变异株HT115，由于该菌株缺乏RNAⅢ型酶，dsRNA在其中能够稳定存在而不易被降解，通过构建带有目的基因片段的dsRNA载体，利用IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导大肠杆菌表达dsRNA，实现dsRNA的低成本简便化大规模生产[10]。在此基础上，马中正等进一步开发了一种基于BL21工程菌的高效合成dsRNA的方法，他们通过基因编辑敲除RNAⅢ编码基因，从而实现dsRNA稳定表达，且表达效率显着高于HT115菌株[11]。Park 等对苏云金芽孢杆菌进行改造，使其合成具有抑制囊状幼虫病毒（Sacbroodvirus，SBV）活性的dsRNA，通过饲喂的方式，这种dsRNA能够抑制鳞翅目昆虫体内囊状幼虫病毒的复制[12]。Leonard 等对蜜蜂肠细菌（Snodgrassellaalvi）进行改造，使其能够在蜜蜂肠道中稳定定殖并产生dsRNA，提高蜜蜂对病毒的抵抗力[13]。简便、低成本dsRNA合成技术的成功研发和应用，加快了RNA农药的发展速度。
3RNA杀菌剂的研发及防治作物病害
3.1 可喷洒型dsRNA
可喷洒型dsRNA是通过外源喷施靶向病原菌基因dsRNA，使病原菌相关基因沉默，达到防治植物病害的自的。直接喷洒具有使用简便、易于推广等优点。喷施在植物表面的dsRNA通过两种方式进入致病菌体内，一种是植物细胞吸收dsRNA，再运输到致病菌体内；另一种是致病菌直接吸收dsRNA。Koch等在植物表面喷洒含有荧光标记的dsRNA，在植物的木质部和韧皮部及筛管部细胞中检测到dsRNA，证明植物细胞可以吸收外源的dsRNA[14]。在植物表面喷施dsRNA后，dsRNA分子能够通过气孔或者伤口进入植物体内，并且可以在植物体内传导[15]，这为可喷洒型dsRNA进入植物体内来抵御有害生物的危害奠定了基础。据研究报道，不同致病菌对dsRNA的吸收率不同，灰霉病菌、核盘菌、立枯丝核菌、黑曲霉菌和大丽轮枝菌能够有效吸收dsRNA，致病疫霉、有益真菌绿木霉菌吸收dsRNA的效率较低，胶孢炭疽菌不能吸收dsRNA[16]。如何提高植物及致病菌对dsRNA的吸收率，提高抑菌效果，是当前研究的热点。Wang等制备了可靶向疫霉菌羧酸酰胺类（CAAs）杀菌剂靶标蛋白纤维素合酶3（CesA3）和氟噻唑吡乙酮的靶标氧化固醇结合蛋白1（OSBP1）关键区域的CesA3－/OSBP1-dsRNAs，将其直接喷施于离体叶片或辣椒幼苗根茎部，能有效防治辣椒疫病[17]。Mcrae等研发出防治葡萄白粉病的可喷洒型dsRNA，合成的靶向基因dsRNA使病菌孢子产量降低了 5 3 % ～ 6 4 % ，并且显着抑制葡萄白粉病的发生[18]。Ding等创制了一种智能响应酸性释放的纳米核酸抗病毒药物，能够有效降低HSP70基因的表达水平，有效抑制烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的发生[9]。由于dsRNA在环境中的稳定性相对低，dsRNA直接喷洒后可能因环境中的RNA酶、紫外线辐射等发生变性或降解，存在RNA干扰持效期较短、效果不稳定等问题，因此需要借助助剂提高dsRNA对病害的防治效果。此外，植物及植物病原菌对dsRNA的吸收效率也是影响RNA杀菌剂效果的重要原因之一。
3.2 纳米材料递送dsRNA
纳米材料与dsRNA结合，不仅能保护dsRNA免受降解，还能增强dsRNA的传递能力，通过纳米材料载体递送dsRNA防治作物病害能够显着提高RNA杀菌剂的防治效果，为新型RNA杀菌剂的研发应用提供了新的突破口。由疫霉菌引起的晚疫病，对马铃薯生产造成了毁灭性的危害，Wang等利用纳米材料星型阳离子聚合物SPc，研发出了一种基于dsRNA和植物免疫诱抗剂的自组装多元纳米新型生物制剂，通过纳米材料载体SPc高效结合和递送dsRNA，可实现对马铃薯晚疫病的防治[20]。Mitter等研发出一种有效防治黄瓜花叶病毒病的RNA农药，其通过纳米材料层状双氢氧化物LHD，通过静电作用结合dsRNA，实现dsRNA的缓慢释放和对黄瓜花叶病毒病的有效防控[21]。Ouyang等同时以PpAE1、PpAE2和 P p A E 3 为靶标，合成了防治大豆锈病菌的dsRNA，使用纳米材料壳聚糖进行装载递送，显着抑制了大豆锈病的发生[22]。Qiao等使用纳米囊泡（AVs）包裹和递送dsRNA，形成AV-dsRNA复合体，AV-dsRNA通过增加dsRNA的稳定性和持久性，AV-dsRNA处理可延长对番茄、葡萄和葡萄叶片的抗灰霉菌的水平，并且延长了dsRNA对作物果实和叶片的保护期[23]。Hao等将沉默玉米感病基因ZmFd3的dsRNA负载到CLPs和ALPs两种脂质体中，降低了因外界环境因素等引起的dsRNA降解，dsRNA-CLPs/ALPs复合体可通过叶片和根部进入玉米体内，抑制玉米褪绿斑驳病毒和甘蔗花叶病毒对玉米的侵染[24]。Sharma等使用纳米粘土作为马铃薯晚疫病靶向基因dsRNA的载体，通过生物活性测定、离叶测定和叶面喷雾法进行抑菌效果评估，结果显示疫霉菌的生长、孢子形成和发病症状显着降低，与dsRNA单用喷雾相比，以纳米粘土作为载体的dsRNA喷雾处理后，抑菌效果显着增加[25]。通过纳米材料载体递送dsRNA 显着提高了dsRNA的稳定性和对dsRNA的转运效率，若将纳米材料作为RNA杀菌剂的助剂使用，会极大提高dsRNA对致病菌的干扰效率，提升RNA杀菌剂的防治效果和持效期。
3.3在作物中表达靶向病原菌dsRNA
通过转基因技术，研究人员能够在寄主作物中表达靶向病原菌dsRNA，从而启动RNA干扰机制，有效杀死或抑制病原菌生长繁殖，提高作物对病害的抗性。Zhang等在棉花中表达了靶向大丽轮枝菌VdHI基因的dsRNA，获得了抗黄萎病棉花株系35S-VdHli，提高了植株对棉花黄萎病的抗性[2。通过干扰SsGlcP基因的表达可有效降低甘蔗鞭黑粉菌的致病力，降低甘蔗黑穗病的发生，Wu等基于农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系，以甘蔗ROC22品种为底盘，成功构建了以SsGlcP基因为靶标的宿主诱导的基因沉默转基因甘蔗，在转基因株系中成功干扰SsGlcP基因，使黑穗病发生率明显下降，与对照相比，转基因株系中黑粉菌的生物量显着下降[27]。Zhu等构建了以合成MAP激酶基因PsFUZ7为靶标基因dsRNA的转基因小麦品系，该品系通过稳定表达dsRNA，降解PsFUZ7基因转录物，从而对小麦条锈病产生良好的抗病性，来抵御小麦条锈病的危害[28]。Nowara等将表达靶向白粉病菌Blumeriagraminis葡聚糖转移酶基因Avral0的dsRNA转入大麦中，构建了转基因大麦品系，显着增强了大麦对白粉病的抗性，有利于白粉病的绿色防控[29]。Wang等在番茄中利用RNA干扰沉默灰葡萄孢Botrytiscinerea的DCL基因，降低了灰葡萄孢的致病性[30]。这些研究充分表明，在作物中表达针对病原菌的dsRNA是一种有效的病害防控策略。然而，转基因作物的研发周期长、成本高及民众接受度差等问题仍然不容忽视，与杀菌剂的研发相比，转基因作物的开发周期通常更长。因此，从商业化应用的可行性和社会接受度等角度考虑，高效杀菌剂的研发是更高效、经济的病害防控方案。
4小结与展望
随着化学农药长期使用产生的病虫抗药性、农药残留和环境污染等问题，急需研发新型生物农药来部分替代化学农药，以在保护环境的基础上，实现对病虫害的有效防控。RNA农药是一类可以特异性结合靶标生物中特定基因，沉默靶标生物体内相应基因的表达[31.32]，从而干扰靶标生物的正常生长及其对寄主植物的危害，具有靶标专一性和环境友好性等特点。随着纳米技术、生物信息技术和现代农业技术的交叉融合，为dsRNA的合成、可喷洒型RNA杀菌剂的研发应用提供了载体[33.34]，有利于新型RNA杀菌剂的开发。
筛选合成能够高效沉默作物病原菌靶向基因的dsRNA是RNA杀菌剂研发的基本条件。由于RNA配对有一定的“容错率”[35]，RNA杀菌剂dsRNA不仅能与靶向基因的信使RNA结合，也存在与序列相似但不完全相同的其他信使RNA结合的可能性，导致其它基因发生沉默，从而降低了对靶向基因的沉默效率。因此，为了防止dsRNA的“脱靶效应”，确保dsRNA的特异性，必须筛选合成高效的作物病原菌靶向基因的dsRNA。
RNA杀菌剂和其他化学农药、生物农药一样，存在其特有的优势，但也存在着特有的弊端，最明显的就是不易维持其环境稳定性[3。dsRNA作为双链核糖核酸分子，农田环境中的高温、紫外线、风雨吹刷等和生物体内的核酸酶均能破坏其稳定性。如何使用纳米材料等包裹和递送dsRNA提高其环境稳定性，是今后研究的重点方向。此外，不同作物、不同病原菌对dsRNA的吸收效率也不同，如何提高dsRNA进人植物和病原菌体内的效率，是实现商业化大规模生产RNA杀菌剂的关键。
《“十四五”全国农药产业发展规划》中指出优先发展RNA及小肽类生物农药，为RNA农药的发展提供了政策保障。但RNA杀菌剂目前还处于室内研究阶段，尚缺少上市的RNA杀菌剂产品和在田间大面积应用防治作物病害的报道，迫切需要加大对RNA农药的研发力度，突破技术壁垒，加快商品化进程。
参考文献：
[1］杨普云，王凯，厉建萌，等.以农药减量控害助力农业绿色发展[J]植物保护，2018，44（5）：95-100.
［2］秦萌，任宗杰，张帅，等．从“农药零增长行动”看“农药减量化”发展［J]．中国植保导刊，2021，41（11）：89-94.
［3］关梅，晁子健，闫硕，等.RNA农药的研究现状和发展前景［J].现代农药，2023，22（2）：11-18.
［4］解昆仑，郭珍，古勤生．“RNAi农药”防治植物病毒病的研究进展[J]．中国植保导刊，2020，40（1）：29－34+54.
［5］宋修仕，高静，周明国．基于RNA干扰的杀菌剂开发及其对化学杀菌剂的影响［J]．农药学学报，2023，25（1）：1-11.
[6］崔锦程，崔洁，卞小莹.生产双链RNA工程菌的研究进展[J/OL]生物工程学报，2025，1-14.
[7]GUANRB，CHUDD，HANXY，etal. Advances in the developmentof microbial double-stranded RNA production systems for applicationofRNA interference inagricultural pestcontrol[J].FrontiersinBioengineering and Biotechnology，2021（9）：753790.
［8］张建珍，柴林，史学凯，等．RNA干扰技术与害虫防治［J］．山西大学学报（自然科学版），2021，44（5）：980-987.
[9]YANGL，TIANY，PENGYY，etal.Expression dynamics of coreRNAimachinery genes in pea aphids upon exposure to artificially synthesizeddsRNAandmiRNAs[J].Insects，2020，11（2）：70.
[10]TIMMONSL，COURTDL，FIREA. Ingestion of bacterially expresseddsRNAs can produce specific and potent genetic interference inCaenorhabditiseleganss[J].Gene，2001，263（1-2）：103.
［11］马中正，闫硕，沈杰.基于工程菌高效合成靶向昆虫基因的dsRNA的方法［J]．应用昆虫学报，2019，56（2）：342-347.
[12]PARKMG，KIMWJ，CHOIJY，etal.Development ofa Bacillusthuringiensisbased dsRNA production platform tocontrol sacbroodvirus inApis cerana[J].PestManagement Science，202o，76（5）：1699 -1704.
[13］LEONARDSP，POWELLJE，PERUTKAJ，etal．Engineeredsymbiontsactivate honey bee immunityand limit pathogens[J]．Science，2020，367（6477）：573-576.
[14］KOCHA，BIEDENKOPF D，FURCHA，et al. An RNAi- Basedcontrol of Fusarium graminearum infections through spraying of longdsRNAs involves a plant passage and iscontrolled by the fungalsilencing machinery[J].PLoS Pathogens，2016，12（10）： e1005901.
[15]。KENNELLY MM， GADOURYD M， WILCOX WF， etal. Primaryinfection，lesionproductivitynduivalofsporangiainteainedowny mildew pathogen Plasmopara viticola.Phytopathology，2007，97 （4）： 512-522.
[16]QIAOLL，CHIL，LUCAC，et al. Spray-induced gene silencing fordisease control is dependent on the efficiency of pathogen RNA uptake[J]．PlantBiotechnology Journal，2021，19（9）：1756－1768.
[17]WANG ZW，LIY， ZHANGB，GAOX，et al. Functionalized carbondot -delivered RNA nano fungicides as superior tools to controlPhytophthora pathogensthrough plant RdRPl mediated spray-induced gene silencing[J]．Advanced Functional Materials，2023，33 （22）： 2213143.
[18]MCRAE AG，TANEJAJ，YEE K，et al. Spray- induced genesilencing to identify powdery mildew gene targets and proceses forpowdery mildew control［J].Molecular Plant Pathology，2023，24（9）： 1168- 1183.
[19]DINGC，JIAOY，LI Y，et al．Anovel pH-responsive multi -component nanodelivery system with siRNA for plant diseasemanagement[J]. Chemical Engineering Joumal，2024（497）：155001.
[20]WANGY，LIM， YINGJ，et al. High-efficiency green managementof potato late blight by a self -assembled multicomponent nano-bioprotectant[J].Nature Communications，2023，14（1）：5622.
[21]MITTERN，WORRALLEA，Robinson KE，etal. Clay nanosheetsfor topical delivery of RNAi for sustained protection against plantviruses[J].Nature plants，2017，3（2）：1-10.
[22]OUYANG HB，SUN G Z，LI K，et al. Profiling of phakopsorapachyrhizi transcriptome revealed co-expressed virulence effectors asprospective RNA interference targets for soybean rust management[J]．Joumal of Integrative Plant Biology.2024，66（11）：2543- 2560.
[23]QIAO L，NINO - SANCHEZ J，HAMBY R，et al．Artificialnanovesicles for dsRNA delivery in spray- induced gene silencing forcrop protection[J]．Plant Biotechnology Journal，2023，21（4）：854-865.
[24]HAO K Q，GAO X R，YANG M，etal. Ananomaterial for the deliveryof dsRNA asa strategy toalleviate viral infectionsinmaizet[J]．Chemical Engineering Journal，2024，488：150923.
[25]SHARMA S， BAIRWAA， TOMAR M，et al. Spraying of dsRNAmolecules derived fromPhytophthora infestans，alongwith nanoclaycarrers asa proof of concept for developing novel protection strategyfor potato late blight[J].Pest Management Science，2022，78（7）：3183.
[26］ZHANGT，JINY， ZHAO JH，et al. Host- induced gene silencingofthe target gene in fungal cells confers effective resistance to thecotton wilt disease pathogen Verticilliumdahliae[J].Molecular plant，2016，9（6）：939-942.
[27]WUH，QIU J，ZHANGP，LU S，et al. Host-induced gene silencingofSporisoriumscitamineum enhancesresistance tosmut in sugarcane[J]．Plant Biotechnology Journal，2025：1-3.
[28]ZHUX，QIT，YANGQ，etal.Host-induced gene silencingof theMAPKK gene PsFUZ7 confers stable resistance to wheatstripe rust[J]．Plant Physiology，2017，175（4）：1853-1863.
[29]NOWARAD，GAYA，LACOMMEC，etal.HIGS：host-inducedgene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeriagraminis[J]．ThePlantCell，2010，22（9）：3130-3141.
[30]WANGM，WEIBERGA，LINFM，et al.Bidirectional cross -kingdom RNAi and fungal uptake of external RNAs confer plantprotection[J]．NaturePlants，2016，19（2）：16151.
[31] 何承帅，张辉，吴顺凡，等.核酸农药纳米递送系统研究进展[J]农药学学报，2023，25（6）：1179-1197.
[32] 程伟，李和平，何水林，等．寄主诱导的基因沉默提高植物真菌病害抗性研究进展［J]．作物学报，2017，43（8）：1115-1121.
［33］关梅，尹佳茗，闫硕，等．纳米递送系统在植物病虫害防控领域的应用与展望［J]．仲恺农业工程学院学报，2024，37（1）：59-66.
［34］闫硕，蒋沁宏，沈杰．纳米农药及载体材料的增效机理研究现状[J]．植物保护学报，2022，49（1）：366－373.
[35] 薛珊，王淑雅，刘丽，等．基于CRISPR/Cas9 的精准基因编辑技术研究进展［J]．生物工程学报，2023，39（7）：2566-2578.
［36］李爽，闫更轩，田缘，等．RNA干扰技术防控作物真菌病害研究进展［J]．北方园艺，2024（3）：127-136.
