基于RNA-seq的大麦苗期抗旱相关基因的挖掘与分析

known 发布于 2025-07-26 阅读(470)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.005

摘" 要:【目的】挖掘与分析大麦苗期抗旱相关基因,为研究大麦分子抗旱机制和选育抗旱大麦品种提供理论支撑。

【方法】以啤酒大麦品种新啤6号为材料,应用转录组测序RNA-seq技术对干旱胁迫前后大麦苗期倒二叶叶片进行转录组测序,并采用实时荧光定量 RT-PCR 方法进行功能基因验证。

【结果】(1)干旱胁迫前后新啤6号倒二叶中3 835个差异表达基因,主要为编码ABC转运蛋白、核糖体蛋白、转录因子、脱水素、过氧化物酶、蛋白质磷酸酶等的基因。(2)DEG主要富集在淀粉和蔗糖代谢、转运蛋白、植物激素信号转导、伴侣和折叠催化剂、氨基糖和核苷酸糖的代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、过氧化物酶体等途径。

【结论】大麦干旱胁迫前后基因表达差异显著(其中上调基因1 592个,下调基因2 243个)。

关键词:大麦;干旱胁迫;转录组;基因挖掘

中图分类号:S512.3""" 文献标志码:A""" 文章编号:1001-4330(2024)05-1077-08

收稿日期(Received):

2023-10-25

基金项目:

财政部和农业农村部: 国家现代农业产业技术体系项目(CARS-05-19B);国家自然科学基金项目(32360456)

作者简介:

鞠乐(1987-),女,河南邓州人,助理研究员,研究方向为杂粮遗传育种与栽培,(E-mail)695112004@ qq.com

通讯作者:

齐军仓( 1971-) ,男,陕西宝鸡人,教授,硕士生/博士生导师,研究方向为大麦遗传育种与栽培,(E-mail)shzqjc@ qq.com

0" 引 言

【研究意义】随着全球气候变暖,水资源紧缺日益突显,干旱频发[1]。干旱是影响作物生长发育的主要非生物限制性因素之一[2]。近年来,每年均因干旱导致作物减产[3],因此,解析作物抗旱机制、培育抗旱作物新品种,对提升作物抗旱能力具有重要意义[4]。【前人研究进展】大麦是抗逆性较强的作物,针对其抗旱性机理的研究多数集中在种子萌发、苗期或成株期有关形态、生理或农艺性状等方面[5-11]。已有大麦种子萌发期[12,13]、苗期[14]、成株期[15,16]等抗旱性鉴定方面的研究。【本研究切入点】目前,虽然在大麦抗旱性研究方面取得一些进展,但关于大麦抗旱分子调控机制的研究相对较少,因此关于大麦干旱分子响应机制方面的研究仍有待加强,需进一步挖掘大麦抗旱性相关基因。【拟解决的关键问题】以新啤6号为材料,应用转录组测序RNA-seq 技术对干旱胁迫前后大麦苗期倒二叶进行转录组测序,挖掘与抗旱相关的差异表达基因,为解析大麦分子抗旱机制和指导大麦抗旱育种提供理论支撑。

1" 材料与方法

1.1" 材 料

供试啤酒大麦品种新啤6号由石河子大学农学院提供,选取健壮饱满的种子,经0.4%高锰酸钾消毒1.5 h,用蒸馏水冲洗干净。

1.2" 方 法

1.2.1" 试验设计

以营养土为培养基质,将100 粒大麦种子点播于塑料盆中,出苗后间苗,每盆留生长一致的幼苗12株,设2个处理:全生长期正常供水,大麦幼苗生长4周后不浇水进行干旱胁迫处理,直到取样(大麦叶片出现半卷状态时进行取样),每个处理6 个重复。将样品(倒二叶叶片)于液氮中速冻,储存于-80℃冰箱中,用于转录组测序试验。

1.2.2" 利用RNA-seq技术进行转录组测序

文库构建和转录组测序由开泰明镜基因科技(北京)有限公司完成。

1.2.2.1" RNA提取及质量检测

首先提取Total RNA,并进行RNA质量检测,符合质量的RNA才可进行后续的文库构建。检测RNA样品:(1) 琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染;(2) Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280比值)。

1.2.2.2" 构建文库

样品检测合格后,使用Oligo(dT) Beads分离得到mRNA;加入打断试剂将mRNA打断成短片段,以此为模板,使用First Strand Synthesis合成第一条cDNA链,加入Second Strand Synthesis Mix合成第二链,经过末端补平和加“A”后,连接上RNA-Seq Adapter,纯化连接产物后进行PCR扩增,使用磁珠纯化回收300~600 bp目的产物进行测序。

1.2.2.3" 文库质检

文库构建完成后,使用Qubit进行初步定量,稀释文库至1 ng/μL,随后使用Qseq100 DNA Analyzer对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2 nM)。

1.2.2.4" 上机测序

库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后使用Illumina NovaSeq 6000平台,PE150测序文库。

1.2.3" 实时荧光定量 RT-PCR 进行功能基因验证

从差异表达基因数据库中挑选5个上调基因,利用Primer 6.0 设计引物,采用实时荧光定量 RT-PCR以验证转录组测序结果的准确性。表1

1.3" 数据处理

生物信息学数据分析由开泰明镜基因科技(北京)有限公司完成。

1.3.1" 原始数据过滤

使用fastp 软件对原始测序数据(Raw Data)过滤,质控包括:(1)去除引物和接头序列(Adaptor);(2)去除片段长度lt;50 bp的序列;(3)去除N碱基达到一定比例的reads(默认设为5 bp);(4)去除质量值小于20的低质量碱基;(5)以4碱基为窗口计算碱基平均质量值,若碱基平均质量值低于20(Q20)则切除。

1.3.2" 参考序列比对

使用hisat2将Clean Data与参考基因组进行相似性比对(mapping),获取 reads在参考基因组上的位置信息,以及测序样本的特征信息。

1.3.3" 新转录本预测

用stringtie软件对Mapped Reads进行拼接,与参考基因组的注释文件比较,寻找新的转录区,确定新转录本以及新基因。

1.3.4" 基因表达量

使用HISAT2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对,利用 stringtie对已知的和新的基因和转录本进行定量表达。

1.3.5" 差异表达基因的GO 和KEGG 富集

使用eggNOG构建go KEGG数据库,使用R包clusterProfiler,对差异基因进行GO和KEGG富集分析。

2" 结果与分析

2.1" 干旱胁迫处理大麦苗期叶片的转录组

研究表明,将干旱胁迫处理前后样品分别命名为CK和T,共检测到3 835个差异表达基因(DEG),其中上调基因1 592个,下调基因2 243个。图1

2.2" 差异表达基因(DEG)功能

研究表明,将P<0.05,差异倍数≥2作为标准筛选DEG,共鉴定到1 618个(496个上调基因和1 122个下调基因)DEG,其中,P<0.05,差异倍数≥8的DEG共84个(32个上调基因和52个下调基因)。鉴定到的1 618个DEG,HORVU.MOREX.r3.3HG0286930上调倍数为8.54、HORVU.MOREX.r3.4HG0386330上调倍数为11.16、HORVU.MOREX.r3.6HG0622770上调倍数为15.66、HORVU.MOREX.r3.2HG0112630下调倍数为10.23、HORVU.MOREX.r3.5HG0479070下调倍数为10.31。1 618个DEG主要为编码ABC转运蛋白、核糖体蛋白、转录因子、脱水素、过氧化物酶、蛋白质磷酸酶等的基因。表2

2.3" 差异表达基因(DEG)功能富集

研究表明,DEG主要富集在94个生物学过程,主要富集在RNA 修饰(GO:0009451)、对含氧化合物的反应(GO:0043207)、内切酶活性(GO:0004519)、叶绿素生物合成过程的调节(GO:0010380)等生物学过程。DEG主要富集在淀粉和蔗糖代谢、转运蛋白、植物激素信号转导、伴侣和折叠催化剂、氨基糖和核苷酸糖的代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、过氧化物酶体等途径。表3,图2

2.4" 实时荧光定量PCR验证

研究表明,挑选的5个基因在干旱处理前后的表达模式与RNA-seq结果一致。表4

3" 讨 论

3.1

RNA-seq是一种快速、有效鉴定差异表达基因的方法,是揭示植物抗逆机理以及筛选抗逆基因的主要技术手段[17-18]。贺小彦[19]利用RNA-seq技术鉴定到野生大麦XZ5干旱胁迫前后根系中216个差异表达基因,并筛选出36个与野生大麦XZ5耐旱相关的差异表达基因,这些基因主要参与抗逆胁迫、抗氧化胁迫、能量代谢、细胞壁修饰等生物学过程。研究利用RNA-seq技术共检测到新啤6号干旱胁迫前后苗期叶片中3 835个差异表达基因(其中上调基因1 592个,下调基因2 243个),主要为编码ABC转运蛋白、核糖体蛋白、转录因子、脱水素、过氧化物酶、蛋白质磷酸酶等的基因;KEGG代谢途径富集分析结果表明,DEG主要富集在淀粉和蔗糖代谢、转运蛋白、植物激素信号转导、伴侣和折叠催化剂、氨基糖和核苷酸糖的代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、过氧化物酶体等途径。宋士伟等[20]研究中共检测到野大麦干旱胁迫前后旗叶中6 868个上调表达基因,2 081个下调表达基因;对6 579个差异表达基因进行KEGG通路分析,这些基因主要富集到136个通路中,主要包括过氧化物酶体、精氨酸和脯氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生等途径。张学雷[21]研究表明,野生大麦通过提高转运体与氧化还原酶活性、增加渗透调节物的合成以提高抗旱能力。上述结果与试验研究结果比较一致。

3.2

试验研究检测筛选到许多与抗旱相关的DEG。当植物遭受干旱胁迫时,主要通过抗氧化酶系统清除活性氧,避免植物组织因活性氧积累而导致氧化损伤[22]。过氧化物酶是一种抗氧化酶,在植物抗旱胁迫过程中发挥重要的作用[23]。试验研究发现,编码过氧化物基因HORVU.MOREX.r3.7HG0671530;编码过氧化氢基因HORVU.MOREX.r3.2HG0181160、HORVU.MOREX.r3.2HG0181170和HORVU.MOREX.r3.7HG0669590;编码超氧化物歧化酶基因HORVU.MOREX.r3.7HG0640950,5个基因在大麦受到干旱胁迫时表达显著上升,可能参与了活性氧清除过程。ABC转运蛋白是植物中重要的抗逆蛋白[24],是一类跨膜蛋白,主要参与信号传导、细胞解毒和跨膜运输等生理过程[25]。研究结果发现7个编码ABC转运蛋白的基因(分别为HORVU.MOREX.r3.3HG0282720、HORVU.MOREX.r3.3HG0286070、HORVU.MOREX.r3.6HG0577120、HORVU.MOREX.r3.7HG0722520、HORVU.MOREX.r3.7HG0665860、HORVU.MOREX.r3.1HG0010450和HORVU.MOREX.r3.4HG0386330)在大麦受到干旱胁迫时表达显著上升,可能参与了对干旱胁迫的响应。转录因子通过调控下游靶基因的表达,进而诱导多种保护机制以应对非生物胁迫[26]。研究结果发现,HORVU.MOREX.r3.3HG0299650、HORVU.MOREX.r3.1HG0090590、HORVU.MOREX.r3.5HG048653、HORVU.MOREX.r3.6HG0617580、HORVU.MOREX.r3.5HG0463120、HORVU.MOREX.r3.3HG0286890、HORVU.MOREX.r3.5HG0463450、HORVU.MOREX.r3.6HG0556820、HORVU.MOREX.r3.3HG0286980、HORVU.MOREX.r3.5HG0443240、HORVU.MOREX.r3.2HG0135680、HORVU.MOREX.r3.3HG0302280、HORVU.MOREX.r3.4HG0391440和HORVU.MOREX.r3.1HG0088760等14个编码不同种类转录因子的基因,在大麦受到干旱胁迫时表达显著上升,可能通过调控相关基因的表达,进而参与对干旱胁迫的响应[27]。研究结果发现,5个编码蛋白质磷酸酶的基因(HORVU.MOREX.r3.7HG0728500、HORVU.MOREX.r3.4HG0389000、HORVU.MOREX.r3.5HG0473680、HORVU.MOREX.r3.3HG0276740和HORVU.MOREX.r3.3HG0302180)在大麦受到干旱胁迫时表达显著上升,可能参与了对干旱胁迫的响应。LEA蛋白参与植物抗逆反应,植物可以通过提高LEA蛋白基因的表达来提高其耐旱性[28]。研究发现HORVU.MOREX.r3.6HG0622770、HORVU.MOREX.r3.6HG0622790和HORVU.MOREX.r3.6HG0622760等3个编码LEA蛋白的基因,在大麦受到干旱胁迫前后差异极显著,基因表达上升极显著,这些基因与大麦抗旱性相关。

4" 结 论

4.1

新啤6号干旱胁迫前后倒二叶中3 835个差异表达基因(其中上调基因1 592个,下调基因2 243个),主要为编码ABC转运蛋白、核糖体蛋白、转录因子、脱水素、过氧化物酶、蛋白质磷酸酶等的基因。

4.2

DEG主要富集在淀粉和蔗糖代谢、转运蛋白、植物激素信号转导、伴侣和折叠催化剂、氨基糖和核苷酸糖的代谢、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、过氧化物酶体等途径。

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RNA-seq-based mining and analysis of drought-related

genes in barley seedlings

JU Le1,2, QI Juncang1, NIU Yinting2, SHI Peichun1, SONG Ruijiao1, SONG Lingyu1,YIN Zhigang2, CHEN Peiyu2, QIANG Xuelan3

(1." College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi Xinjiang 832003, China; 2. Academy of Agricultural Sciences, Nanyang City, Nanyan Henan 473000, China;3. Bureau of Agriculture and Rural Development, Wancheng District, Nanyang Henan 473000, China)

Abstract:【Objective】 To excavate the genes related to drought resistance in the hope of providing theoretical support for analyzing the molecular drought resistance mechanism of barley and guiding the drought resistance breeding of barley.

【Methods】 Taking New beer No.6 as the test material, we applied transcriptome sequencing RNA-seq technology to sequence the inverted bilobed leaves of barley seedlings before and after drought stress, and real-time fluorescence quantitative RT-PCR was used to verify the functional genes.

【Results】 (1) In this study, 3835 differentially expressed genes were detected in the inverted bilobed of New beer 6 before and after drought stress by using RNA-seq, mainly genes encoded by ABC transporter proteins, ribosomal proteins, transcription factors, dehydrins, peroxidases, protein phosphatases, etc.The results showed that DEG was mainly enriched in starch and sucrose metabolism, transporter proteins, plant hormone signaling transduction, and protein phosphatases.(2) By KEGG metabolic pathway enrichment analysis, DEGs were mainly enriched in starch and sucrose metabolism, transporter proteins, phytohormone signaling, chaperones and folding catalysts, aminosugar and ribosugar metabolism, phenylalanine metabolism, taurine and hyposulphite metabolism, peroxisomes and other pathways.

【Conclusion】" Significant differences are shown in gene expression before and after drought stress in barley.The results of this study have laid the foundation for the excavation of key drought-resistant genes and for further analysis of drought-resistant mechanisms in barley(1592 up-regulated genes and 2243 down-regulated genes) .

Key words:barley; drought stress; transcriptome; gene mining

Fund projects:The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-05-19B); National Natural Science Foundation of China(32360456)

Correspondence author: QI Juncang ( 1971-), male, from Baoji, Shaanxi, professor, doctoral supervisor,research direction: Genetic breeding and cultivation techniques of barley, (E-mail) shzqjc@ qq.com

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