doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.05.026
摘" 要：【目的】研究体内干扰Zfy基因对驴睾丸、附睾组织中Zfy蛋白表达以及精子发育相关基因表达的影响。
【方法】选取健康种公驴，将一侧睾丸注射空载体作为对照组，另一侧睾丸注射Zfy干扰载体作为干扰组。采集睾丸、附睾组织，分别制作冰冻切片、固定液中固定及液氮中保存。使用冰冻切片观察载体绿色荧光蛋白在组织中的表达情况。使用免疫组化和HE染色观察干扰组和对照组Zfy蛋白表达情况。通过RT-qPCR检测干扰Zfy基因对睾丸、附睾中精子生成相关基因SYCP3、STRA8、TNP2、FAS表达水平的影响。
【结果】绿色荧光蛋白主要在驴曲细精管中的圆形精子细胞和部分长形精子细胞中表达，干扰载体成功转入；干扰组驴睾丸Zfy蛋白表达量显著下调；干扰Zfy基因使驴睾丸中SYCP3基因表达量显著下调、附睾中TNP2和FAS基因表达量显著下调、而睾丸和附睾中STRA8基因表达量没有明显差异。
【结论】驴Zfy基因主要在驴圆形精子中表达，干扰Zfy基因可显著抑制驴睾丸中Zfy蛋白表达、SYCP3基因表达和附睾中TNP2、FAS基因表达。
关键词：驴；基因干扰；Zfy基因；免疫组化；圆形精子细胞
中图分类号：S822""" 文献标志码：A""" 文章编号：1001-4330（2024）05-1277-07
收稿日期（Received）：
2023-09-30
基金项目：
新疆维吾尔自治区重点研发计划项目“驴高效繁殖关键技术集成与示范”（2020B01002-2-1）；山东省农业重大应用技术创新项目（SD2019XM008）;新疆维吾尔自治区科技重大专项“草食家畜高效繁殖技术研究与示范”
作者简介：
李梦雨（1996-），女，新疆人，硕士研究生，研究方向为动物遗传育种，（E-mail）1132629130@qq.com
通讯作者：
贾斌（1965-），男，新疆石河子人，教授，博士，硕士生/博士生导师，研究方向为分子遗传与抗病育种，（E-mail）jiabin@shzu.edu.cn
0" 引 言
【研究意义】Zfy基因位于Y染色体的短臂（Yp11.3），包含11个外显子和1个随机重复区域。编码的蛋白质富含13个“锌-指”结构，并具有转录因子功能，成为Y染色体链接的锌指蛋白转录因子（Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor），X染色体长臂（Xp21.3-Xp22.1）上有其等位基因Zfx［1］。最初，Zfy基因被认为是睾丸决定因子（Testis Determining Factor，TDF）的候选基因，在雄性个体睾丸生长发育过程中发挥作用［2］。性别决定由另一个存在与Y染色体上的SRY基因负责［3］。【前人研究进展】在Y染色体短臂缺失的小鼠模型中转入Zfy基因能确保第二次减数分裂的发生［4］；Yasuhiro等［5-6］则发现，Y染色体Zfy2基因负责调控小鼠圆形精子细胞转化为精子。Zfy基因在精子形成中具有重要作用，尤其是在减数分裂和Y精子形成时期。【本研究切入点】在小鼠、湖羊和猪的睾丸中，干扰Zfy基因能够显著偏移子一代的性别比例，以达到控制后代性别的目的［7-9］。需要通过基因调控探究干扰Zfy基因后对睾丸组织中Zfy蛋白表达以及精子发育相关基因的影响。【拟解决的关键问题】通过体内注射Zfy基因干扰载体，观察驴睾丸中Zfy蛋白表达情况，分析睾丸和附睾中精子生成相关基因SYCP3（联会复合体蛋白3基因）、STRA8（视黄酸激活基因）、TNP2（过渡蛋白2基因）和FAS（Ⅰ型跨膜受体蛋白）的表达，为驴的性别控制研究提供理论支持。
1" 材料与方法
1.1" 材 料
1.1.1" 试验动物
选取青河县梦圆种植养殖合作社3岁健康种公驴。
1.1.2" 主要试剂及仪器
Anti-Zfy抗体（Abcam）、PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒、DAPI染液（中山金桥生物技术有限公司）、中性福尔马林固定液（西陇科学技术有限公司）、苏木精、伊红（北京中衫金桥生物技术有限公司）、石蜡切片机（型号为LM2235，德国莱卡）、体视显微镜、LightCycler 96 全自动荧光定量PCR仪（Roche）、倒置荧光显微镜（BIO-RAD DNA Engine）
1.2" 方 法
1.2.1" 干扰载体的构建
试验根据NCBI中公布的驴Zfy基因CDS区序列，设计并筛选shRNA干扰片段并命名为Y-1，shRNA寡核苷酸序列如下：Y-1-F：5-TGGATACAGAGTTGGGTATTTTCAAGAGAAATACCCA ACTCTGTATCCTTTTTTC-3;Y-1-R：5-TCGAGAAAAAAGGATACAGAGTTGGGTATTTCTCTT GAAAATACCCAACTCTGTATCCA-3。将干扰序列连接到PLL3.7质粒中，经转化后挑取单个菌落进行扩大培养，并进行测序鉴定，获得含有目的片段的干扰载体。
1.2.2" 驴睾丸注射
采用单点注射法分别注射3 mg载体，左侧睾丸注射空载体，右侧睾丸注射Y-1干扰载体。间隔24 h注射第2次，第2次注射结束后24 h，采集新鲜睾丸组织及附睾组织分别置于-20℃冷冻用于制作冰冻切片、置于固定液固定用于HE染色和免疫组化，以及液氮中冻存用于提取总RNA。
1.2.3" 驴睾丸冰冻切片制作
采集试验组、对照组的驴睾丸组织进行OCT包埋，迅速在-20℃的冰冻切片机中切成18 μm的组织切片，贴附在粘附性载玻片上，立即用荧光显微镜观察蓝色DAPI和绿色荧光蛋白的表达情况。
1.2.4" 驴睾丸组织HE染色和组织学特性测定
采集新鲜睾丸组织进行常规石蜡包埋，在石蜡切片机上切成3.5 μm的连续切片，烘干后置于4℃保存备用。
HE染色：将组织切片进行烤片、脱蜡完成后进行苏木精染色5 min，冲洗30 s，1%盐酸酒精酸化1 s，自来水浸泡3 min返蓝，冲洗30 s，伊红染色3 min，冲洗30 s，脱色晾干并封片。
免疫组化：参照PV-6001二步法免疫组化检测试剂盒进行，将脱蜡完成的切片进行水化和修复，使用0.5%过氧化氢室温避光孵育10 min，PBS清洗，滴加稀释倍数为1：200的一抗（Anti-Zfy兔多克隆抗体）50 μL，4℃过夜孵育，清洗后滴加二抗（酶标山羊抗兔IgG聚合物）50 μL室温孵育30 min，清洗后DAB显色剂显色，苏木精复染后使用1%盐酸酒精酸化，封片后置于显微镜下观察。
1.2.5" 驴睾丸、附睾组织相关通路基因mRNA表达水平检测
选择FAS、STRA8、TNP2、SYCP3基因，设计实时荧光定量PCR引物，并送至上海生工合成。提取睾丸和附睾组织中的mRNA，反转录为cDNA，通过荧光定量PCR 仪进行RT-qPCR检测，采用 2 - ΔΔCt方法计算基因表达的相对比值，比较干扰前后驴睾丸和附睾中精子生成相关基因mRNA表达水平。
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）引物如下：FAS-F（5-3）：GCCTGCTGTCAGTCATGTCCTC; FAS-R（5-3）：TGTGGCTTGTCTGTGTAGTCCTTC扩增产物片段长度为125 bp，退火温度为60℃；STRA8-F（5-3）：GCCTGCTGTCAGTCATGTCCTC; STRA8-R（5-3）： TGTGGCTTGTCTGTGTAGTCCTTC扩增产物片段长度为80 bp，退火温度为59℃；TNP2-F（5-3）：ATCACAGTCATACCACGCACTCC; TNP2-R（5-3）： CCTCTTCACCGCCTTCCTCTTG扩增产物片段长度为122 bp，退火温度为61℃；SYCP3-F（5-3）：GCGACTCTTGAAGGACCACG; SYCP3-R（5-3）：ACCTCCTCCTCTGAACCACTC扩增产物片段长度为152 bp，退火温度为55℃。
1.3" 数据处理
免疫组化结果使用ImagePro Plus 6.0 （Media Cybernetics，美国）统计分析载体Y-1组和空载体对照组的平均光密度值，检测蛋白相对表达量差异，数值经SPSS 20.0 独立样本T检验分析和GraphPad Prism 5.0作图。统计结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示。P＜0.05 表示显著差异，P＜0.01 表示极显著差异。
2" 结果与分析
2.1" 驴Zfy基因干扰载体的构建
研究表明，与插入片段结果一致，Zfy基因重组干扰载体构建成功。
2.2" 驴睾丸转染效果观察
研究表明，注射的干扰载体成功进入了驴睾丸曲细精管中，并表达出绿色荧光蛋白。绿色荧光显示分布在圆形精子细胞和部分管腔中央的长形精子细胞中。图1
2.3" 驴睾丸组织形态结构及Zfy蛋白的表达
研究表明，Zfy蛋白表达均位于细胞胞浆中，特异性抗体染色后为淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒，呈弥漫性分布。蛋白的表达沿着曲精细管管腔中央开始向周围，颜色呈现有规律的先逐渐加深然后再逐渐变浅。靠近管腔正中心的长形精子和紧挨着的一圈圆形精子着色浓密较深，蛋白表达量较高。图2
空载体组为平均光密度0.167±0.009，干扰载体注射组为0.133±0.004，差异极显著（Plt;0.01）。图3
2.4" 驴睾丸、附睾组织精子发育相关基因mRNA表达水平检测
研究表明，驴睾丸组织干扰组与对照组相比，SYCP3基因表达量下降了74.95%，差异极显著（Plt;0.01），STRA8、TNP2和FAS基因表达量均差异不显著（Pgt;0.05）。附睾组织干扰组与对照组相比，TNP2和FAS基因表达量分别下降了59.12%和58.47%，差异极显著（Plt;0.01）；SYCP3基因和STRA8基因表达量均差异不显著（Pgt;0.05）。图4～5
3" 讨 论
3.1
试验显示，干扰载体成功转染入睾丸曲精细管的生精细胞，携带的绿色荧光蛋白表达于生精细胞中，与Cheng等［10］研究相符，证明部分细胞器和物质信息可以穿透血睾屏障以及胞质桥。免疫组化结果分析表明，注射48 h后，驴睾丸组织的Zfy蛋白表达量显著下降，这表明干扰载体成功抑制了Zfy蛋白的表达，这与Takizawa等［11］在小鼠睾丸中的RNA干扰试验结果一致。研究还发现锌指蛋白可以调控转录过程，与DNA结合，从而调控DNA上相关基因的表达。当Zfy基因被沉默后，性别相关基因SYCP3的表达降低。
3.2
联会复合蛋白3（SYCP3）编码的蛋白组成一个高度延伸的四聚体结构，通过其N端区域的棒状结构具有结合DNA的能力。在进化中，SYCP3的一级结构尤其是最后6个氨基酸表现出保守性［12-13］。体外分析表明，SYCP3与DNA结合和自主组装驱动了减数分裂时期染色体的紧缩［14］。SYCP3主要在初级精母细胞中表达，并参与第1次减数分裂偶线期同源染色体配对过程中联会复合物的形成。在雄鼠中，SYCP3的降解会导致SC结构和联会形成失败，进而使使得减数分裂时期细胞凋亡，从而导致雄鼠完全不育。而在雌鼠中，这会导致高非整倍体率使胚胎发生宫内死亡，从而导致生育能力降低［15-16］。对敲除SYCP3基因的纯合雄性小鼠试验表明，试验鼠睾丸体积明显变小，而且伴随着大量生精细胞凋亡［17］。试验中，通过干扰Zfy基因的转录后水平，成功地降低了睾丸组织中SYCP3基因的表达量，降低幅度为74.95%。SYCP3是同源染色体联会配对成功的重要因素，由于其表达量下降或基因缺失会造成减数分裂的停滞。Zfy基因的沉默引起了Y精子上与联会复合体相关基因mRNA的表达降低，致使精液中Y精子畸形率高。
3.3
李贤新等［18］研究发现，小鼠TNP2基因的表达与小鼠精子发生过程有很强的一致性。TNP2在圆形精子中特异表达，其缺失可能导致精子头部畸形，从而影响精子的获能以及顶体与卵细胞的融合［19］。在精原细胞成熟期间，睾丸特异的生精细胞组蛋白变异逐步代替体细胞的组蛋白。而在精子变态早期，转型蛋白TNP2又替代了生精细胞中的组蛋白［20］。附睾是精子成熟的重要场所。试验中，干扰组附睾组织TNP2基因表达量下降了59.12%，由于
TNP2参与精子变态发育过程中转型蛋白或鱼精蛋白为主导的精子细胞核蛋白的转换，TNP2基因的下调可能导致精子头部畸形，从而影响顶体精子与卵细胞的结合、精子获能以及在雌性生殖道的迁移。Kleene等［21］研究表明，FAS介导的级联反应对生殖细胞凋亡具有重要作用。FAS属于肿瘤坏死因子与神经生长因子受体家族，与其天然受体FasL特异性结合能够诱导靶细胞凋亡。该种Fas/FasL系统介导的“Ⅱ型”细胞凋亡途径是哺乳动物睾丸生精细胞凋亡的一条主要途径。试验中，附睾组织中FAS表达量下降了58.47%，差异极显著，干扰Zfy基因可能会造成Y精子的发育异常，进而导致凋亡增加，但与预期相反，FAS基因的下调可能抑制了细胞凋亡。抗凋亡蛋白BCL-2能够明显抑制FasL/Fas介导的细胞凋亡［22］。干扰Zfy基因导致的FAS基因表达量下调的具体机制仍需深入研究。
4" 结 论
构建的Zfy基因干扰载体能成功进入到驴睾丸组织中，并显著下调睾丸组织中Zfy蛋白的表达。体内干扰Zfy基因使睾丸组织中SYCP3基因的表达量降低了74.95%，差异极显著（Plt;0.01），并且导致附睾组织中TNP2和FAS基因的表达量分别下降了59.12%和58.47%，差异极显著（Plt;0.01）。干扰后抑制了驴精子发育相关基因睾丸组织中SYCP3基因、附睾组织中TNP2和FAS基因的表达，引起精子的受精几率产生差异。
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Effect of interfering donkey Zfy gene in vivo on expression of spermatogenesis related genes
LI Mengyu1， ZHANG" Zhidong2， LYU Yihang1， SUN Yujiang3， ZHENG Xinbao4，5， XIAO Haixia4，5， JIA Bin1
（1.College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832003， China； 2. Ili Kazakh Aotonomous Prefecture Animal Husbandry Station， Yining Xinjiang 835100， China; 3.Qingdao Agricultural University， Qingdao Shandong 266169， China;4.Institute of Animal Science， Xinjiang Academy of Animal Sciences， Urumqi 830000， China; 5. Key Laboratory of Livestock and Poultry Resources （Sheep amp; Goat） Evaluation and Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Urumqi 830000， China）
Abstract：【Objective】 To explore the effect of interfering with the Zfy gene in vivo on the expression of Zfy protein in donkey testis and its epididymis tissues， as well as the expression of genes related to sperm development.
【Methods】"" Two healthy male donkeys were selected. An empty vector was injected into one testicle as the control group， and a Zfy interference vector was injected into the other testicle as the interference group. Testis and epididymis tissues were collected and processed into frozen sections， fixed in fixative solution， and stored in liquid nitrogen. The expression of green fluorescent protein in tissues was observed using frozen sections. The expression of Zfy protein in the interference and control groups was observed using immunohistochemistry. The impact of Zfy interference on the expression levels of sperm development-related genes SYCP3， STRA8， TNP2，" and FAS in the testis and epididymis was detected using RT-qPCR.
【Results】" The experimental results showed that the green fluorescent protein was mainly expressed in round sperm cells and part of long sperm cells in convoluted spermatic tubules， indicating the successful transfer of the interference vector. The expression level of Zfy protein in the interference group was significantly down-regulated， and interference with Zfy gene led to a significant decrease in SYCP3 gene expression in the testis and a significant decrease in TNP2 and FAS gene expression in the epididymis. However， there was no significant difference in the expression level of the STRA8 gene between the testis and epididymis.
【Conclusion】 The Zfy gene in donkeys is mainly expressed in round sperm cells. Interference with the Zfy gene significantly inhibits the expression of Zfy protein， SYCP3 gene in the testis， and TNP2 and FAS gene expression in the epididymis.
Key words：donkey;gene interference; Zfy gene;" immunohistochemistry; round sperm cell
Fund projects：Key R amp; D Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region： \"Integration and Demonstration of Key Technologies for Efficient Donkey Breeding\" （2020B01002-2-1）; 2019 Agricultural Major Application Technology Innovation Project of Shandong Province （SD2019XM008）; Major Science and Technology Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region \"Herbivorous Livestock Efficient Breeding Technology Research and Demonstration\"
Correspondence author：JIA Bin （1965-）， male， from Shihezi，Xinjiang，professor，Ph.D.，doctoral supervisor， research direction： molecular genetics and breeding for disease resistance， （E-mail）jiabin@shzu.edu.cn
