摘 要：【目的】研究陆地棉GHWAT1-35基因在棉花纤维发育过程中的作用。
【方法】选用陆地棉系9花后不同时期的纤维为材料，克隆GHWAT1-35基因的全长cDNA序列，并进行生物信息学、实时荧光定量（qRT-PCR）分析及亚细胞定位。
【结果】该基因全长1 125 bp，编码374个氨基酸，相对分子量为40.231 kDa，理论等电点为8.74。GHWAT1-35蛋白与亚洲棉亲缘关系最近。GHWAT1-35基因在开花后15 d表达量显著升高，亚细胞定位预测表明该蛋白定位于细胞质膜上。将GHWAT1-35基因与pCAMIA1300-35S-YFP载体重组，构建融合表达载体，利用冻融法转化农杆菌，注射到烟草后观察到GHWAT1-35蛋白定位在细胞质膜上。
【结论】陆地棉系9 GHWAT1-35基因在开花后15和20 DAP的表达量显著高于其他时期，pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于细胞质膜上。
关键词：陆地棉；WAT1；基因克隆；生物信息学；亚细胞定位
中图分类号：S562"" 文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）06-1310-08
0 引 言
【研究意义】棉花纤维品质高低直接影响棉纺织品的质量［1， 2］。纤维发育是棉花生长发育过程中至关重要的环节，其中涉及了多个基因的调控和作用［3］。因此，棉花质量也成为原棉竞争力的关键要素。研究陆地棉GHWAT1-35基因在棉花纤维发育过程中的作用，对挖掘棉花纤维发育相关基因具有重要意义。【前人研究进展】Walls Are Thin 1（WAT1）是一种植物特异性蛋白，其功能早在拟南芥中已被揭示［4］。Ranocha等［5］研究发现，WAT1是一种液泡膜上的转运蛋白，在拟南芥各个组织器官中均有表达，在茎和下胚轴表达量最高，这些组织均具有相对较高比例的次生壁细胞。NAC转录因子NST1和NST3是植物次生壁合成的关键调节因子，其参与转录级联的激活，促进次生壁的生物合成［6］。在拟南芥WAT1突变体中转录因子SND1和NST1的表达下调，其靶基因KNAT7和MYB103表达量也显著降低，该2个转录因子在植物纤维次生壁合成过程中发挥着至关重要的作用。拟南芥WAT1是液泡膜上的转运蛋白，可促进生长素进入植物液泡中，从而维持植物内部生长素的平衡。拟南芥WAT1突变体植株木质素含量降低、茎纤维次生细胞壁厚度降低、生长素运输受阻、茎中生长素含量显著降低［7］。彭方林等［8］发现，At1g01070基因位于拟南芥的细胞质膜上，超表达该基因筛选得到纯和株系，发现其参与调控拟南芥的开花时间，可促进拟南芥幼株株高增加和幼根生长。Ju等［9］发现，WAT1参与陆地棉果枝发育过程，在鲁棉研28号和新陆中77号2个品种之间植株结构差异显著，前者果枝节间距较长，株型疏松；后者果枝节间距较短，株型紧凑。RNASeq和qRT-PCR结果表明，生长素信号转导在鲁棉研28号中是正调控的，但在新陆中77号中受到负调控，鲁棉研28号的生长素明显含量高于新陆中77号。Tang等［10］在GhWAT123沉默的陆地棉中发现，水杨酸（SA）相关基因的表达显著上调，导致水杨酸含量升高。木质部发育受到抑制，造成木质素沉积［11， 12］。Hanika等［13］利用VIGS技术瞬时沉默番茄植株中的SlWAT1基因，对经过SlWAT1基因沉默的植株进行筛选，并测试其对番茄黄萎病病原体的抗病性。结果表明，沉默后的番茄植株的萎缩程度显著降低，SlWAT1在番茄中作为黄萎病感病因子发挥着重要作用。在盐、干旱、低温环境胁迫下，香蕉中MaWAT1s表达量显著上调［14］。WAT1蛋白可通过参与生长素、水杨酸等激素的代谢过程调控植物生长发育与抗逆反应［15］。【本研究切入点】由于WAT1蛋白在植物生长发育中发挥重要作用，而在陆地棉纤维发育过程中，WAT1蛋白的作用机制鲜有报道，需要进一步克隆和分析WAT1蛋白相关基因。【拟解决的关键问题】以陆地棉系9的纤维组织为材料，克隆得到GHWAT1-35基因，对其进行生物信息学和亚细胞定位分析，分析GHWAT1-35的功能，为深入探究该基因在棉花纤维发育过程中的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材 料
选择陆地棉系9（简称系9）开花后（DPA）不同发育阶段（0、5、10、15、20、25和30 DPA）的棉纤维组织及本氏烟草叶片。
1.2 方 法
1.2.1 总RNA 的提取与克隆
采集陆地棉系9不同发育时期的纤维组织，并立即用液氮进行速冻后，置于-80℃冰箱保存，备用。使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取纤维样品中的总RNA，并检测RNA的浓度以确保质量合格。以提取的总RNA作为模板，根据FastKing cDNA第一条链合成试剂盒说明书进行反转录实验，并将反转录产物置于-20℃冰箱保存待用。在CottonFGD数据库中，下载GHWAT1-35基因CDS序列。以反转录合成的cDNA作为PCR模板，进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带的特异性。
1.2.2 生物信息学
利用ExPAXSy-ProtParam在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）对目的蛋白GHWAT1-35的理化性质进行分析，并使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）和SignaIP（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）在线工具对蛋白是否存在跨膜区和信号肽进行预测。使用InterPRO（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）对GHWAT1-35蛋白的功能结构域进行预测。使用NCBI网站BlastP工具对GHWAT1-35进行分析，得到多个物种的WAT1同源蛋白序列，利用GeneDoc软件进行氨基酸序列比对，利用MEGA5软件构建系统发育进化树。运用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）同源建模方法预测分析蛋白质的二级和三级结构。利用WoLF PSORT网站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位预测。使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线网站预测GHWAT1-35的启动子顺式作用元件。
1.2.3 GHWAT1-35实时荧光定量表达
以系9开花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纤维组织为材料，提取总RNA后反转录得到cDNA。以棉花GhUBQ7作为荧光定量的内参基因，设计qRT-PCR引物，根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）说明书进行qRT-PCR。采用2-ΔΔct法计算基因相对表达量［16］，并用GraphPad Prism 9绘图。
1.2.4 融合表达载体的构建
使用EcoRI和SpeI限制性内切酶对pC1300-35S-YFP载体进行双酶切，并使用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重组试剂盒，将目的片段GHWAT1-35构建至线性化的pC1300-35S-YFP载体中，获得的重组产物转化至大肠杆菌（DH5α）感受态细胞［17］。挑取重组反应转化平板上的单克隆进行菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测，将条带大小符合的产物送至上海生工生物有限公司进行测序，获得重组质粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP，在验证正确的菌液中加入50%的甘油，置-80℃冰箱保存备用。
活化冻存的农杆菌（GV3101）感受态细胞，通过质粒液氮冻融法将重组质粒pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP转化至农杆菌感受态细胞中［18］，将菌液涂布于含卡那和利福平霉素抗生素的LB固体培养基上，28℃暗培养，待长出单克隆后鉴定阳性克隆，在阳性菌液加入等体积50%的甘油，置于-80℃冰箱保存备用。
将含有重组融合表达载体pC1300∷35S-GHWAT1-35-YFP的农杆菌进行过夜培养后，加入提前制备的悬浮液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES，100 μmol/L AS），室温下避光静置3 h，用于后续试验侵染［19］。
选取4～5叶期长势好的本氏烟草叶片，用注射器吸取悬浮液，注射到烟草叶片下表皮细胞中［20］。以转入空载体的烟草叶片作为阴性对照，注射后培养72 h，取样并使用激光共聚焦荧光显微镜观察叶片中YFP荧光蛋白信号分布［21］。
2 结果与分析
2.1 系9 GHWAT1-35基因的克隆
研究表明，以系9总RNA反转录合成的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增得到GHWAT1-35基因。获得条带清晰、条带大小为1125 bp的cDNA片段，扩增产物序列与陆地棉GHWAT1-35基因序列一致，GHWAT1-35基因克隆成功。图1
2.2 GHWAT1-35基因的生物信息学
研究表明，该蛋白质的分子式为C1842H2900N458O498S25，编码374个氨基酸，分子量为40.23 kDa，理论等电点为8.74。其中，Gly占氨基酸总数的含量最多（10.3%），14个残基带负电荷（Asp+Glu）和24个残基带正电荷（Arg+Lys）。不稳定系数为20.03，为稳定蛋白，脂肪系数为68.47。在14位的疏水性值最强为2.367（max），在337位亲水性值最强为-2.233（min），亲疏水性总平均值为-0.978，属于亲水性蛋白。预测该蛋白共有22个磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）15个，苏氨酸（Thr）5个，酪氨酸（Tyr）2个。在该蛋白质中存在9个跨膜区，但不存在信号肽。图2～5
与亚洲棉、雷蒙德氏棉、海岛棉、橡胶树、榴莲、可可、黄麻的相似性分别为99.73%、98.67%、88.50%、84.2%、82.38%和74.18%。系9 GHWAT1-35蛋白与亚洲棉和雷蒙德氏棉的亲缘关系较近，与黄麻、可可亲缘关系较远。该蛋白质序列中存在2个EamA保守结构域，分别位于第16～第148和第184～第322氨基酸处，属于EamA like转运蛋白家族。在二级结构中，α螺旋占52.14%，β转角占3.74%，无规则卷曲占25.13%，延伸链占18.98%。图6～10
GHWAT1-35拥有CGTCA-motif（参与MeJA反应的顺式调节元件）、MBS（MYB结合位点，干旱诱导响应元件）、GT1-motif（光响应元件）、P-box（赤霉素响应元件）、ARE（厌氧诱导所必需的顺式调节元件、O2-site（玉米醇溶蛋白代谢调节的顺式作用元件）等顺式作用元件。表1
2.3 "GHWAT1-35基因表达
研究表明，检测基因在开花后0、5、10、15、20、25和30 DPA的纤维组织的表达水平。在开花后不同时期的纤维组织中，该基因均有表达，并且在第15、20 DPA的表达量相对较高，具有显著差异。GHWAT1-35基因可能在棉花胚珠及纤维发育中发挥重要作用。图11
2.4 亚细胞定位
研究表明，推测GHWAT1-35蛋白定位于细胞质膜。将构建的GHWAT1-35基因与pC1300-35S-YFP载体重组，并将其瞬时转化到烟草细胞中，该基因在细胞核中无表达，呈现光滑的连续信号，可能定位于细胞膜。加膜marker共同注射后观察，加入膜marker并进行质壁分离后，35S∷GhWAT1-35-YFP信号和mCherry的红色信号一样质壁分离后内缩进胞内；而未质壁分离时35S∷GhWAT1-35-YFP信号和mCherry信号基本吻合。GhWAT1-35定位于细胞质膜。图12
3 讨 论
3.1
WAT1蛋白是植物生长素运输的关键蛋白，生长素在促进木质素纤维分化过程中起到重要作用［7， 22，23］。研究从系9中克隆到GHWAT1-35基因，全长1 125 bp，编码374个氨基酸。陆地棉WAT1蛋白与亚洲棉、雷蒙德氏棉中的WAT1蛋白高度同源，其与亚洲棉相似度最高。WAT1蛋白含有EamA保守结构域，含有该结构域的蛋白可能具有内在膜蛋白的生物特性［24］。拟南芥WAT1蛋白参与生长素的运输，维持植物体内生长素的动态平衡。拟南芥WAT1突变体茎中生长素转运受阻，生长素含量降低，茎部纤维次生细胞壁厚度降低。而喷施外源生长素后，WAT1突变体可生长素运输和次生壁厚度恢复到正常水平。香蕉MaWAT1s基因在不同组织器官和亚细胞的表达均存在差异，在不同时期喷施生长素后的MaWATs表达量显著高于对照组。在棉花和番茄中同时瞬时WAT1同源基因可增强植株对黄萎病的抗性［25］。说明WAT1蛋白在不同物种和组织中可能具有不同的功能［26， 27］，基因结构对基因编码蛋白的进化和功能具有重要影响［28］。
3.2
棉花纤维发育大致可分为4个相互重叠的时期：起始、伸长、次生壁加厚、脱水成熟［29］。棉纤维的伸长始于开花期，而绒毛纤维的伸长始于开花后5～10 d，生长时间持续约20 d。棉纤维次生壁加厚阶段是发育的关键时期，始于棉花开花后15 d，在这一阶段，细胞主要合成并沉积纤维素［30］。分析发现GHWAT1-35在纤维发育的各个时期均有表达，但其在不同时期表达量具有差异性，在15、20 DAP表达量显著高于其他时期。
GHWAT1-35基因定位于细胞质膜上，与前人研究拟南芥At1g01070基因的亚细胞定位结果一致［8］。
4 结 论
克隆陆地棉系9 GHWAT1-35基因，GHWAT1-35的CDS区序列全长为1125bp，编码374个氨基酸，为稳定亲水性蛋白。GHWAT1-35的序列上有两个EamA保守结构域，无信号肽。系9GHWAT1-35基因在开花后15和20 DAP的表达量显著高于其他时期，其在纤维发育中发挥重要作用。pC1300∷35S-WAT-YFP融合蛋白定位于细胞质膜上。
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Cloning and subcellular localization of the GHWAT1-35 gene in Gossypium hirsutum
Abstract：【Objective】 To explore the role of GHWAT1-35 gene in the development of cotton fibers.
【Methods】 "In this study， the fiber at different developmental stages post-anthesis of Gossypium hirsutum variety Xi9 were used as materials.The full-length cDNA sequence of the GHWAT1-35 gene was successfully cloned and subjected to bioinformatics analysis， real-time fluorescence quantitative （qRT-PCR） analysis， and subcellular localization.
【Results】 "The length of the GHWAT1-35 gene was 1125 bp， encoding 374 amino acids， with a relative molecular weight is 40.23 kDa and a theoretical isoelectric point of 8.74.Protein multiple sequence alignment and construction of a systematic evolutionary tree analysis showed that the GHWAT1-35 protein was most closely related to the Gossypium arboreum.The expression of the GHWAT1-35 gene significantly increased at 15 days after flowering， and subcellular localization predicted that the protein was located on the cytoplasmic membrane.The GHWAT1-35 gene was recombined with the pCAMIA1300-35S-YFP vector to construct a fusion expression vector， which was then transformed into Agrobacterium using the freeze-thaw method and after being injected into tobacco.The GHWAT1-35 protein was observed to be located on the cytoplasmic membrane.
【Conclusion】 The GHWAT1-35 gene plays an important role in fiber development， providing a foundation for further exploration of its biological function in Gossypium hirsutum.
Key words：Gossypium hirsutum; WAT1; gene cloning; bioinformatics; subcellular localization
