摘 要：【目的】研究不同绵羊品种产羔数候选基因的遗传效应。
【方法】以4个绵羊品种（多浪羊468只、德国美利奴羊152只、萨福克羊157只、湖羊600只）为样本，利用扩增受阻突变体系PCR技术（ARMS-PCR）、限制性内切酶片段长度多态性技术（RFLP）等方法，检测4个繁殖力候选基因COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB遗传多态性，并分析其多态性与产羔数相关性。
【结果】COIL基因g.7 321 466Ggt;C位点在多浪、德国美利奴、萨福克、湖羊上突变纯合GG基因型频率在0.3左右，在多浪羊中CC基因型极显著高于CG、GG，CG基因型极显著高于GG；德国美利奴羊中GG基因型显著高于CG、CC，CG基因型显著高于GG；在萨福克、湖羊中GG、CG基因型极显著高于CC。BMPRIB基因在湖羊中BB、B+基因型产羔数极显著高于++，但其他品种效果不理想。FSHR基因g.75 320 741Cgt;T位点、CUCY基因g.43266624Ggt;A位点对绵羊产羔数影响较低。
【结论】COIL基因g.7321466Ggt;C位点有望替代BMPRIB基因成为新的产羔数性状选育的分子标记。
关键词：绵羊；COIL；FSHR；GUCY1A1；BMPRIB；产羔数
中图分类号："" 文献标志码：A"" 文章编号：1001-4330（2024）06-1544-09
0 引 言
【研究意义】产羔数性状的遗传力低，基因型选择较传统方法会获得较大的遗传进展，因此，产羔数功能基因和分子标记的研究成为热点。繁殖力性状如排卵率和产羔数可以由许多影响较小的基因进行遗传调节，有时也可以由单个影响较大的基因进行遗传调节［1］。【前人研究进展】BMPRIB基因（FecB）是影响Booroola羊的繁殖力基因［2］，近年来，在中国的湖羊［3］、小尾寒羊［4］中发现了FecB基因对产羔数的影响，但对其他绵羊品种产羔数影响不大。例如，在一些绵羊品种如滩羊、杜泊、萨福克和美利奴中，BMPRIB基因多态性与产仔数无显著关联［5］。【本研究切入点】COIL影响卵母细胞的受精数量从而影响小鼠的繁殖力，敲除COIL导致每胎产仔数降低，影响小鼠整体生存力和繁殖力［6］。可溶性鸟苷酸环化酶会影响卵母细胞的减数分裂从而影响动物排卵［7］。促卵泡激素（FSH）由脑垂体前叶分泌，将影响卵泡的发育中卵母细胞的减数分裂。在缺乏足够FSH的情况下，卵泡不能在早期窦期之后生长和成熟，会导致排卵不发生［8］。COIL、GUCY1A1、FSHR对绵羊产羔数有影响，但未进行不同品种的大群检验。急需寻找一个更有效的候选基因或分子标记位点。【拟解决的关键问题】以4种绵羊品种（多浪羊468只、德国美利奴羊152只、萨福克羊157只、湖羊600只）为样本，利用扩增受阻突变体系PCR技术（ARMS-PCR）、限制性内切酶片段长度多态性技术（RFLP）等方法，检测4个繁殖力候选基因COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB遗传多态性，并分析其多态性与产羔数相关性。
1 材料与方法
1.1 材 料
采集麦盖提刀郎阳光农牧科技有限公司羊场468只多浪羊、库尔勒羊场152只德国美利奴羊、哈密健坤牧业羊场600只湖羊、玛纳斯日发西域羊场157只萨福克健康经产母羊（2～3胎次）血样（均为双羔的母羊），同时选取少量单羔的作为对照。
1.2 方 法
1.2.1 基因组DNA提取
采用酚-氯仿抽提法，提取基因组DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整度与质量。
1.2.2 聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术
参照第三版《分子克隆试验指南》方法。
1.2.3 扩增受阻突变体系PCR技术（ARMS-PCR）
根据筛选到的FSHR基因g.75320741Cgt;T，序列号NC_019460.2；GUCY1A1基因g.43266624Ggt;A，序列号NC_019474.2；COIL基因g.7321466Ggt;C，序列号NC_019468.2在线NCBI网络平台设计引物，由上海生物工程技术有限责任公司合成。表1
ARMS-PCR反应体系为PCR Mix：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为10、10、10 μL；ddH2O：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为6.6、7、6 μL；内引物上游F1：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为0.9、0.8、1.2 μL；内引物下游R1：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为0.9、0.8、1.2 μL；外引物上游F2：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为0.3、0.2、0.3 μL；外引物下游R2：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为0.3、0.2、0.3 μL；DNA：COIL、GUCY1A1、FSHR分别为1、1、1 μL。
ARMS-PCR反应程序：
94℃预变性5 min，94℃变性30 s，35个循环，（COIL、FSHR）62℃退火30 s/GUCY1A1 61℃退火30 s，35个循环，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.3 数据处理
数据用Excel整理统计；群体遗传规律的计算可使用POPGENE32、PIC-CALC能帮助快速计算基因型频率、基因纯合度（Ho）、基因频率、基因杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）及多态信息含量（PIC）。利用SPSS 23.0中单因素方差分析对平均产羔数和突变位点基因型进行关联分析，产羔数以“平均数±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 绵羊基因组DNA检测
研究表明，片段清晰，没有拖尾，1、2号泳道是多浪羊基因组；3、4号泳道是德国美利奴羊基因组；5、6号泳道是萨福克羊基因组；7～9号泳道是湖羊基因组DNA。图1
2.2 BMPRIB基因的PCR扩增产物检测
研究表明，目标片段扩增特异性良好，得到140 bp大小目标片段，无其他杂带，可用作后续试验。1、2号泳道为多浪羊PCR扩增产物；3、4号泳道为德国美利奴羊PCR扩增产物；5、6号泳道为萨福克羊PCR扩增产物；7～9号泳道为湖羊PCR扩增产物。图2
2.3 BMPRIB基因的PCR-RFLP检测
研究表明，1、3、4、6号泳道为野生型++基因型，2、5号泳道为B+基因型；德国美利奴羊PCR-RFLP检测结果，1、2号泳道为B+基因型，3、4、5号泳道野生型++基因型；湖羊PCR-RFLP检测结果，1、3、4、5、7号泳道为突变纯合BB基因型，2号泳道野生型++基因型，6号泳道为B+基因型；萨福克羊PCR-RFLP检测结果，1～5号泳道为野生型++基因型，未检出突变。图3
2.4 COIL、FSHR、GUCY1A1基因的ARMS-PCR扩增产物检测
2.4.1 COIL基因的ARMS-PCR扩增产物检测
研究表明，多浪羊1号泳道为突变纯合GG基因型，2、3、4号泳道为CG基因型；5号泳道为野生型CC基因型；德国美利奴羊6号泳道为突变纯合GG基因型，2、3、5号泳道为CG基因型；1、4号泳道为野生型CC基因型；湖羊2号泳道为突变纯合GG基因型，3号泳道为CG基因型；1、4～7号泳道为野生型CC基因型；萨福克羊5号泳道为突变纯合GG基因型，1、3、4号泳道为CG基因型；2号泳道为野生型CC基因型；条带清晰、且片段大小正确、分型成功。图4
2.4.2 FSHR基因的ARMS-PCR扩增产物检测
研究表明，多浪羊1、7号泳道为野生型CC基因型，2～6号泳道为CT基因型；德国美利奴羊1～3、5号泳道为野生型CC基因型，4号泳道为CT基因型；湖羊2、4号泳道为野生型CC基因型，1、3、5号泳道为CT基因型；萨福克羊1、2、5号泳道为野生型CC基因型，3、4号泳道为CT基因型；条带清晰，且片段大小正确、分型成功。图5
研究表明，多浪羊1、3～6、8号泳道为野生型CC基因型，2、7号泳道为CT基因型；德国美利奴羊1、2号泳道为野生型CC基因型，3～5号泳道为CT基因型；湖羊3号泳道为野生型CC基因型，1、2、4号泳道为CT基因型；萨福克羊3号泳道为野生型CC基因型，1、2、4号泳道为CT基因型；条带清晰，且片段大小正确、分型成功。图6
2.5 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因的遗传多样性
2.5.1 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4个绵羊品种中的基因型频率、等位基因频率
研究表明，在多浪羊、德国美利奴羊、湖羊3个品种中G等位基因是优势等位基因；在萨福克羊中C等位基因是优势等位基因。在4个绵羊群体中C等位基因为优势等位基因。在4个绵羊品种中G等位基因为优势等位基因。在湖羊中B等位基因是优势等位基因；在多浪、德国美利奴羊中+等位基因为优势等位基因。表2
2.5.2 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4个绵羊品种中的Ho、He、Ne和PIC
研究表明，COIL基因在湖羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，在4个绵羊品种中均为中度多态位点。FSHR基因在萨福克羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，在多浪羊、德国美利奴羊中为中度多态位点，在萨福克羊、湖羊上为低度多态位点。GUCY1A1在德国美利奴、萨福克、湖羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。4个品种均为低度多态位点。BMPRIB基因在多浪羊、德国美利奴羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态，在湖羊中为中度多态位点，多浪羊、德国美利奴羊中为低度多态位点。表3
2.6 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4个绵羊品种中的基因型与产羔数的关联性
研究表明，COIL基因在多浪羊中，CC基因型产羔数极显著高于（Plt;0.01）CG、GG基因型，CG基因型产羔数极显著高于（Plt;0.01）GG基因型；德国美利奴羊GG基因型产羔数显著高于（Plt;0.05）CG、CC基因型，CG基因型产羔数显著高于（Plt;0.05）CC基因型；萨福克羊、湖羊GG、CG基因型产羔数极显著高于（Plt;0.01）CC基因型。FSHR基因在多浪羊、德国美利奴羊中，CT基因型产羔数显著高于（Plt;0.05）CC基因型，在萨福克羊、湖羊中，CT基因型产羔数及显著高于（Plt;0.01）CC基因型。GUCY1A1基因在多浪羊群体中，GA基因型产羔数显著高于（Plt;0.05）GG基因型；在德国美利奴羊群体中，GG基因型产羔数极显著高于（Plt;0.01）GA基因型。BMPRIB基因在多浪羊群体中，B+型产羔数显著高于（Plt;0.05）++型；德国美利奴羊中B+、++ 2种基因型对应产羔数之间不显著（Pgt;0.05）；湖羊群体中，BB、B+ 2种基因型产羔数都极显著高于（Plt;0.01）++型。表4
3 讨 论
3.1 COIL基因对不同绵羊品种产羔数的影响
敲除COIL对小鼠整体生存力和繁殖力有影响，缺少coil基因的小鼠出现明显的生育力和繁殖力缺陷［6］。试验通过筛选也发现COIL基因与产羔数密切相关。马海玉［9］发现COIL基因通过影响蛋白翻译过程的运输和定位来调节繁殖机制，COIL基因可以显著的提高绵羊纤维细胞的增殖和活性。在不同绵羊品种中均分型得到3种基因型；在与产羔数关联分析发现对产羔数有显著影响。
3.2 FSHR、GUCY1A1基因对不同绵羊品种产羔数的影响
促卵泡激素受体（FSHR）在动物卵泡发育中起重要作用，FSHR在超排羔羊和正常羔羊卵巢主要表达于卵泡颗粒细胞［10］。马海玉［9］发现FSHR与卵泡发育进程有关。对于调节减数分裂恢复和卵母细胞成熟的完成也有作用，而且FSHR的纯合突变是有害的，通过这些影响排卵导致其对繁殖性能的影响。小尾寒羊和湖羊具有与产羔数相关的FSHR基因g.47Cgt;T多态性位点［11］。Pan等［12］将FSHR基因型与产羔数关联分析表明，FSHR基因的同义突变g.-47Cgt;T与产仔数有明显的相关；研究发现FSHR基因已经与卵巢衰竭有关，纯合子可能是一个有害的变异体的个体［13］。未在4个不同绵羊品种中发现突变纯合，也可能是纯合突变TT型有害致死，但还有待进一步研究。
NO在排卵过程中的调节作用，GUCY1A1基因的突变会破坏一氧化氮的组成结构，使卵母细胞停止减数分裂对排卵产生影响从而导致绵羊对繁殖力降低［14］。有研究表明NO对于卵泡发育是必需的，eNOS在选择排卵的优势卵泡中的作用［15］。Guo等［16］发现补充精氨酸可能会调节卵巢中关键的NO/PGC-1α信号通路基因的表达，从而加速排卵过程。马海玉［9］在GUCY1A1基因g.43266624位点成功在和田羊和阿勒泰羊中分型，并且发现此位点的突变在一定程度上会降低和田羊和阿勒泰羊的产羔能力。在4种绵羊中发现2种基因型，无纯合突变，GUCY1A1在4种绵羊群体中均属于低度多态，这个位点的突变几率小，选择潜力较小。
3.3 BMPRIB基因对不同绵羊品种产羔数的影响
FecB是首个在绵羊中鉴定出的具有高繁殖性能的关键基因，与提高绵羊的排卵量和产羔量密切相关。研究发现，在湖羊中BB、B+2种基因型产羔数都极显著高于++型，BB型与B+型对应产羔数之间不显著结果和前人结果一致［17、18］。在多浪羊中发现2种基因型（B+、++），B+型产羔数显著高于++型与柏雪梅等［19］研究结果一致。在德国美利奴羊中发现2种基因型（B+、++），B+、++2种基因型对应产羔数之间不显著，与王钧［18］未在德国美利奴羊中发现BMPRIB基因的B等位基因突变个体相比，试验研究的样本量较大，发现了少量的B等位基因突变个体；与刘学峰等［20］在纯种德国肉用美利奴羊（德肉美）和东北细毛羊仅含有稀少的B+基因型个体结果一致。杨永林等［21］利用FecB基因标记辅助选择技术，选育扩繁多胎萨福克新品系。在萨福克羊中只有++基因型，BMPRIB基因不是影响萨福克羊多羔性状的基因，需要进一步发掘其他基因。
4 结 论
COIL基因对4个绵羊产羔数影响显著，可以作为筛选多浪羊、德国美利奴羊、萨福克羊、湖羊高繁殖率的新候选基因。
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Analysis of genetic effects of candidate genes for lambing numbers in different sheep breeds
Abstract：【Objective】 To explore candidate genes affecting lambing number in different sheep breeds.
【Methods】" Four sheep breeds （468 multi-wave sheep， 152 German merino sheep， 157 Suffolk sheep and 600 lake sheep） were used as samples， and the genetic polymorphisms of four fecundity candidate genes COIL， FSHR， GUCY1A1 and BMPRIB were detected by amplification hindered mutation system PCR technology （ARMS-PCR） and restriction enzyme fragment length polymorphism （RFLP）， and the correlation between polymorphisms and lambing number was analyzed.
【Results】"" The frequency of homozygous GG genotype in C-site of coil gene g.7321466Ggt;C was about 0.3 in Duolang， German Merino， Suffolk and Hu sheep， CC genotype was significantly higher than that of CG and GG， and CG genotype was significantly higher than that of GG.The GG genotype in German merino sheep was significantly higher than that of CG and CC， and the CG genotype was significantly higher than that of GG.In Suffolk and Hu sheep， the GG and CG genotypes were significantly higher than those of CC.The association between BMPRIB gene genotype and lambing number in Hu sheep showed that the number of lambing of BB and B+ genotypes was significantly higher than that of ++， but the effect of other breeds was not satisfactory.The T locus of FSHR gene g.75320741Cgt; and the g.43266624Ggt;A locus of CUCY1A1 gene had low effects on lambing in sheep.
【Conclusion】" The g.7321466Ggt;C locus of COIL gene is expected to replace BMPRIB gene as a molecular marker for the breeding of lamb number traits.
Key words：sheep; COIL; FSHR; GUCY1A1; BMPRIB; number of lambs
