摘要：" 以刺五加腋芽为材料，研究了压切培养技术对试管苗增殖的作用，筛选出增殖培养基配方：MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。结合此技术诱导试管苗分化，增殖倍数达4.0倍，可使新分化的芽苗快速进入自主生长，叶片展开，生长势强，有利于培养试管壮苗，为生根培养奠定基础。
关键词：" 刺五加；" 压切技术；" 增殖培养
中图分类号：" "S 567. 1 + 90. 43" " " " " " " "文献标识码：" "A" " " " " " " " 文章编号：１００1 － 9499（２０25）01 － 0013 － 04
Effect of Pressure-cutting Culture on Differentiation andProliferation in Stem Tips of Acanthopanax senticosus
TIAN Xinhua GUO Qi WANG Fude LI Yanxia**
（Forestry Research Institute of Heilongjiang Province，" Heilongjiang Harbin 150081）
Abstract In order to clarify the effect of pressure-cutting culture on the proliferation of tube seedlings， we used axillary buds of Acanthopanax senticosus as the study material and screened the proliferation medium： MS+KT1.0 mg/L+6-BA1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L. We found that a 4-fold increase in stem tip proliferation of tube seedlings， and led to a rapid growth of newly differentiated axillary buds， leaf unfolding and vigorous growth. This study facilitates the optimization of tube seedlings and provides a basis for rooting culture.
Key words Acanthopanax senticosus; pressure-cutting culture; proliferation culture
刺五加（Acanthopanax senticosus）为五加科，多年生落叶灌木，主要分布在中国东北、华北、陕西及俄罗斯和朝鲜等地[ 1 ] 。刺五加的根、根茎、根皮均可入药，具有益气健脾、补肾安神、抗肿瘤、增强机体免疫力的功效[ 2 - 4 ]，是极其珍贵的药物资源。刺五加的嫩芽可以作为蔬菜、茶叶，因其含有皂苷、黄酮、挥发油等特殊成分，营养价值也非常髙[ 5 - 7 ]。
刺五加种子质量差，存在严重的生理后熟[ 8 ]，经处理后萌发率仍低于30%[ 9 ]。刺五加组培过程一直存在微体生长速度慢、分化增殖困难，苗木不生根等技术难题，组织培养技术体系尚不成熟，严重制约了刺五加良种化进程。因此，本试验通过对刺五加优良单株展开研究，采用原创压切培养方法，结合激素种类和浓度的筛选，攻克微体培养过程中的技术难关，提高苗木存活率，培育出试管壮苗，促进苗木生根，建立完善的组培体系，从而推动优良品种的推广与应用。
1 试验材料与方法
1. 1 供试材料预处理
2月初采集伊春市金山屯林场的刺五加优良单株休眠枝条为供试材料，用清水反复冲洗，然后置于有光照的室内，温度控制在20～25 ℃，待休眠芽开始萌动即可利用。
1. 2 外植体的灭菌处理
待腋芽萌发后，剪取长约1.0 cm的单芽茎段，用软毛牙刷刷洗带刺茎段，放入烧杯中上面覆盖纱布，流水冲洗2 h。在超净工作台上进行不同灭菌处理：
（1）2% NaClO浸泡4 min，用无菌水冲洗3次；
（2）75% 酒精浸泡30s，0.1% HgCI2浸泡2min，然后用无菌水冲洗3次；
（3）紫外线直射5 min，0.1% HgCI2浸泡4 min，然后无菌水浸泡30 min；
（4）0.1% HgCI2浸泡6 min，然后无菌水浸泡30 min。
以上材料灭菌后取出，用无菌滤纸吸干材料表面多余水分。每组处理8个腋芽，重复2次，7 d后观察效果。
1. 3 诱导侧芽生长
在超净工作台的无菌环境下，将带芽的茎段接种于MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖 +琼脂粉6 g/L培养基上（pH值调至5.8～6.0），诱导芽苗生长。
1. 4 压切培养与试管苗分化增殖
待腋芽伸长、叶片展开后，转接于以MS为基本培养基，分别添加不同浓度激素的培养基中进行培养（表1），培养基中添加蔗糖30g/L，日产琼脂粉6 g/L。采用L9（34）正交试验设计表进行试管苗增殖培养基筛选。每个处理接种10瓶，重复2次，无菌条件下结合压切技术培养试管苗，40 d后调查苗木的长势及分化情况。
1. 5 培养条件与数据统计
培养温度控制在（24±2）℃，光照强度2 000 Lux，光照时长12 h/d。采用dps19.05统计软件进行方差分析和差异显著性测验（LSD法）[ 11 ]。
2 结果与分析
2. 1 不同灭菌处理的效果
获得无菌材料是组织培养过程的重要初始环节，要求选用的灭菌方法在保证对外植体损伤、褐化最小的前提下，降低污染率。由表2可见，处理1灭菌不充分，污染率较高（43.75%）；处理4灭菌过度，尽管污染率较低，但苗木损伤严重，大量褐化，严重影响外植体生长，甚至导致外植体死亡；处理3污染率为18.75%，褐化率25.00%，其他外植体均表现正常，是较适宜的灭菌方法。
2. 2 诱导侧芽生长
将获得的无菌外植体转接入MS+KT 1.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.4 mg/L培养基上诱导培养10 d左右开始萌动，经一周培养叶片展开，培养30 d后新生出叶片4～5片，叶片展开，叶色新绿，但主茎生长缓慢。在培养过程中每培养一周时间就转接入新的培养基中，这种方法可减少褐化的产生。
2. 3 压切技术在试管苗分化增殖培养中的应用
2. 3. 1 植物压切培养技术
压切培养技术是经长期试验摸索总结出来的一种试验操作技术，该技术适用于无主茎或主茎生长缓慢，增殖困难，分化苗弱、成苗率低的植物。利用此项技术，在保证新分化出的幼苗获得足够营养的同时，又为其独立生存创造条件，从而有利于提高分化苗的存活率，有利于培育出健壮试管苗，为生根培养奠定物质基础。
2. 3. 2 结合压切培养技术筛选增殖培养基
将经诱导培养的基础苗分别转入不同增殖培养基中培养20 d后，待有分化苗产生后，在超净工作台无菌条件下，利用镊子整体夹出，采用压切方法部分切割，给分化苗基部造成伤口，然后整体转接入相同处理的新培养基中，继续培养20 d后，观察到伤口处慢慢长出白色营养瘤，新分化出的小苗叶片展开，叶色转绿，生长势强于未经压切培养处理的分化苗。然后将分化苗彻底分离，独立培养，获得健壮的试管苗。试验结果经极差分析（表3），从各因素对苗木性状影响的极差结果反应：对于试管苗有效叶片数性状而言，A因素极差5.15，B因素2.00；C因素1.82；D因素1.97；对于增殖倍数而言，A因素极差1.43，B因素0.75；C因素0.38，D因素0.27；即无论从有效叶片数还是分化增殖情况来讲，KT（A）都是决定苗木生长分化的重要因素。从各因素对苗木性状影响的均值结果反应： 对于试管苗有效叶片数性状而言，A因素的均值K2＞K3＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K3＞K1＞K2；D因素K2＞K1＞K3；对于增殖倍数而言，A因素的均值K3＞K2＞K1，B因素K3＞K2＞K1；C因素K1＞K3＞K2，D因素K2＞K1＞K3，即对苗木生长状况影响最大的因素A（KT），其次是B因素（6-BA），并且分化数随着他们浓度升高而增加。但在试验中苗木还有其他反应：即随他们浓度增高，主茎生长会更慢，易形成丛生苗，叶片小，色淡，分化苗不易分割，分离往往造成苗木损失。方差分析结果（表4）表明，各因素间差异极显著（p＜0.01）。按F值大小分析，影响苗木有效叶片数、分化增殖的主要因素仍是KT。按照植株上部生长情况的多重比较结果显示（表5），以处理6培养的试管苗分化增殖苗数较多，叶片展开，有效叶片数也较多，便于压切培养，培养过程中苗木损失少，且与其他处理差异显著。因此，选择培养基（即处理6）MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 1.5" mg/L+NAA 0.2 mg/L为刺五加的分化增殖培养基，分化苗数较多，叶色深绿，顶芽新绿，植株生长健壮。
2. 3. 3 压切培养对苗木生长的作用
将经压切技术与增殖培养（处理6）相结合培养的苗木与直接分化培养的苗木进行对比：结合培养出来的分化苗顶芽新绿，下部叶色深绿，叶片展开，主茎较粗，分离母体后可快速吸收营养，启动自主生长能力强，存活率比直接切离母体的试管苗提高20%左右。
3 讨 论
3. 1 刺五加属于药食兼用植物，一般长梗刺五加用作药用，短梗刺五加做为蔬菜。从基础苗木培养方面看，菜用品种更易培养，生长分化速度也较快；药用品种则需要较长时间的前期积累，因品种不同无菌苗可能需要2个月左右的预培养，才能转接入分化增殖培养阶段。
3. 2 在植物组织培养中易出现外植体或培养物褐化现象，这主要是切割外植体使植物受到创伤刺激，细胞内的酚类物质流出，被氧化为褐色的醌类物质，产生褐变现象，导致植物生长受阻，甚至死亡，又称之为酚污染现象[ 10 ]。目前可以通过不同的处理方法抑制外植体褐变：加入抗氧化剂、吸附剂、改变渗透压[ 12 ]或低温处理[ 13 ]等，但不同物种抑制褐变的方法也不尽相同，应结合植物的具体生长情况选择适宜的方法。本试验在初代培养时通过不断转换培养基减少褐变，效果较好。
3. 3 刺五加属于不易打破自身生物调控的植物，先要获得理想的培养结果，应结合生长季进行。压切培养是一种新型培养技术，适用于无主茎或主茎生长缓慢、不易伸长的植物。通过与其他培养方法结合，可以大大减低苗木死亡，有效提高分化苗存活率。
参考文献
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