摘 要：【目的】研究不同相态下娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei A144挥发性物质对苹果树腐烂病菌壳囊孢Valsa mali的抑制效果，并进行体外检测，确定具有抑菌活性挥发性物质种类。【方法】采用平板对扣法测定不同生长时期（0、10、20、25、30 d）娄彻氏链霉菌A144挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果，使用顶空固相微萃取和气相色谱-串联质谱法检测分析其挥发性物质的含量，分别采用平板对扣法和涂抹法得出液态和气态处理下具有较好抑菌活性的挥发性物质。【结果】当娄彻氏链霉菌A144生长至20 d时，菌株A144产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制率为100%；生长至20 d的菌株A144共产生了63种挥发性物质。当浓度为62.50 μL/L时，愈创木酚、1-辛醇和二甲基三硫气态熏蒸处理仍能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长；将原液稀释8倍后，即体积分数为12.5% 的1-辛醇和二甲基三硫液态处理仍能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长。【结论】挥发性物质单体化合物1-辛醇和二甲基三硫具有显著抑制苹果树腐烂病菌的能力，有潜力作为抗苹果树腐烂病的重要开发农药药剂来源。
关键词：娄彻氏链霉菌；生长时期；挥发性物质；苹果树腐烂病菌
中图分类号：S188 文献标志码：A 文章编号：1001-4330（2024）10-2475-09
收稿日期（Received）：2024-04-08
基金项目：新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题（2020D04032）；新疆维吾尔自治区青年基金项目（2022D01B172）；新疆农业科学院青年骨干创新能力培养项目（xjnkq-2023015、xjnkq-2023013）
作者简介：黄伟（1991-），男，新疆阿图什人，助理研究员，研究方向为有益微生物代谢产物，（E-mail）1428775150@qq.com
通讯作者：张丽娟（1986-），女，山东人，副研究员，研究方向为微生物资源，（E-mail）532172011@qq.com
王玮（1973-），女，新疆人，研究员，博士，研究方向为微生物资源，（E-mail）mypony926@163.com
0 引 言
【研究意义】我国是世界上最大的苹果生产和消费国，苹果栽培面积及总产量均居世界第一［1］。由黑腐皮壳Valsa mali引起的苹果树腐烂病是苹果树的主要病害［2-3］，可使树皮腐烂，枝条枯死，最终造成苹果树死亡［4-5］。目前对苹果树腐烂病防治主要措施包括农业防治、化学防治和生物防治，粗放管理果园将加重苹果树腐烂病的发生程度，长期大量施用化学农药易导致病原菌的抗药性。因此，筛选安全、高效、低毒的新型生物农药具有实际意义。【前人研究进展】利用拮抗菌及其代谢产物防治植物病害是极具前景的方法［6-7］。拮抗菌产生的挥发性物质（volatile organic compounds，VOCs）可以在常温常压下快速挥发，进入气相状态，扩散并达到控制植物病害的目的［8］，作用机理主要有抑制植物病原菌的生长、孢子萌发，干扰病原菌代谢，诱导植物产生抗病性等［9-10］。Mccain［11］报道了微生物产生的挥发性物质具有抑菌作用，灰色链霉菌Streptomyces griseus产生的挥发性物质对炭疽病菌Gleosporium aridum的孢子形成具有很强的抑制效果。Fiddaman 等［12］报道细菌也可以产生抑菌挥发性物质，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisNCIMB 12376菌株产生的挥发性物质可以显著抑制立枯丝核菌Rhizoctonia solani和终极腐霉Globisporangium ultimum的生长。解淀粉芽胞杆菌T-5产生的挥发性物质使番茄青枯病原菌Ralstonia solanacearum毒力相关基因表达量下降，病原菌代谢活性受到影响，运动性相关基因表达减少，移动能力受限［13］。拮抗菌产生的挥发性物质熏蒸处理不会与果蔬直接接触，在常温下易挥发，易降解，不易在果蔬表面残留，因此在防治果蔬采后病害方面具有广泛的应用前景［14］。【本研究切入点】来自耐辐射微生物资源库中的娄彻氏链霉菌A144，其代谢产物蛋白、脂肽和挥发性物质对苹果树腐烂病原菌均表现出一定的抑制效果［15］，然而，对菌株A144挥发性物质单体化合物抑制苹果树腐烂病菌的研究尚未深入。【拟解决的关键问题】测定并分析娄彻氏链霉菌A144菌株产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑菌成分，测试在气态熏蒸和液态直接接触两种相态条件下的有效抑菌成分，为该菌株及挥发性物质在苹果树腐烂病菌病害防治上的应用提供理论依据。
新疆农业科学第61卷 第10期黄 伟等：不同相态娄彻氏链霉菌A144挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果
1 材料与方法
1.1 材 料
菌株：菌株A144分离自中国辐射污染区，经鉴定为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei），保存于新疆农业科学院微生物应用研究所耐辐射微生物资源库；苹果树腐烂病原菌（Valsa mali）为中国农业大学李健强教授赠送。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDB）、ISP2培养基均购自青岛海博生物有限公司。苯乙醇、二甲基三硫、二甲基二硫、3-羟基-2-丁酮、苯甲醇、2，3-丁二醇、愈创木酚、香叶基丙酮、1-辛醇等挥发性物质均购自上海麦克林生化科技股份有限公司。无水硫酸钠购自天津市北联精细化学品开发有限公司。
仪器与设备：DHP-052型恒温震荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），SX-500型高压灭菌锅（日本TOMY公司），FA-2204型电子天平（上海衡平仪器仪表厂），Rot ina 380r型高速冷冻离心机（郑州长城科工贸有限公司），SW-CJ-2FD型无菌超净工作台（苏州净化设备有限公司），B-300旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司），50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头及萃取手柄（上海安谱实验科技股份有限公司），TQ8040NX三重四极杆型气质联用仪（日本岛津公司）。
1.2 方 法
1.2.1 不同生长时间的菌株A144挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果
分别在ISP2和PDA培养基中活化菌株A144和苹果树腐烂病原菌，待苹果树腐烂病菌培养7 d后，取直径为8 mm的菌饼，放置于新的PDA培养基中；将菌株A144在新的ISP2培养基平板中划线铺满，去掉培养皿皿盖，与含苹果树腐烂病菌菌饼的培养皿对扣，使用两层封口膜密封，此计为0 d，以此类推，在菌株A144生长至第10、20、25和30 d时，均采用上述操作，每处理重复3次，置于28℃培养箱中培养5 d，采用十字交叉法测量苹果树腐烂病菌的菌落直径，计算抑制率。抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。
1.2.2 菌株A144挥发性物质的测定
提取：参考黄伟等［16］方法，在菌株A144生长时期为第20 d时取出提取。
顶空固相微萃取：用于顶空固相微萃取的光纤（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）在250°C下预处理30 min［17-18］。将预先清洁的纤维插入含有10 mL样品的100 mL顶空萃取瓶中，并在95℃下浸泡1 h。随后，将纤维手动插入注射器端口，并在250℃下解吸5 min［19］。
色谱使用岛津 InertCap WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）的气相色谱-质谱仪分离喷油器在无分流模式下工作。注入器、界面和离子检测器的温度分别为230、250和220℃。5.0级He用作载气，流速为1 mL/min。柱在50℃下保持2 min，然后以3℃/min的速度上升至100℃，最后以4℃/min的温度上升至240℃并保持4 min。EI离子源在70 eV下采集，全扫描质量（m/z）在采集范围为45～500 amu。根据质谱数据库NIST 08和FNSC 1.3库比较质谱，以确定挥发性有机化合物的鉴定［20］。
1.2.3 不同相态挥发性物质纯品测定Valsa mali的抑菌活性
1.2.3.1 挥发性物质气态熏蒸测定Valsa mali的抑菌活性
按照平板对扣法，培养皿体积为80 mL，除去培养基体积20 mL，培养皿对扣后体积为140 mL。使用移液枪分别移取8.75、17.50、35.00和70.00 μL的液态挥发性物质纯品置于1.5 mL灭菌离心管盖中，因此对应挥发物纯品含量分别为62.50、125.00、250.00和500.00 μL/L。在温度为28℃的培养箱中培养5 d，采用十字交叉法测量苹果树腐烂病菌的菌落直径，计算抑制率。抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。
1.2.3.2 挥发性物质液态处理测定Valsa mali的抑菌活性
使用移液枪移取挥发性物质纯品100 μL，此计为原液，然后用无水乙醇分别稀释2、4、8倍，即体积分数分别为50%、25%和12.5%的挥发性物质，对照组为无水乙醇溶液，吸取不同稀释倍数的挥发性物质液体100 μL于PDA培养基表面，使用涂布棒将其涂抹均匀，再在培养基中打一个直径为0.8 cm的孔，接入苹果树腐烂病菌菌饼（直径同样为0.8 cm），置于28℃下培养5 d，采用十字交叉法测量苹果树腐烂病菌的菌落直径，计算抑制率。抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。
1.3 数据处理
采用SPSS 20软件的Duncan氏多重比较检验法进行差异显著性分析（P＜0.05，差异显著），Excel绘制图表。
2 结果与分析
2.1 不同生长时间的A144挥发性物质对Valsa mali的抑制效果
研究表明，采用平板对扣法检测不同生长时间（0、10、20、25 和30 d）A144挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果并计算出抑制率，随着生长时间的延长，抑制效果整体呈先增强后减弱的趋势，其中生长至20 d的A144产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果最佳，抑制率达到100%，高于其他生长时期，达到显著性差异（Plt;0.05）；当生长时期为30 d时A144产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌已无抑制效果，抑制率降为0%。图1～2
2.2 菌株A144产生的挥发性物质测定结果
研究表明，采用顶空吸附法收集生长至20 d的A144产生的挥发性物质，获得总离子流图，菌株A144共产生了63种挥发性物质，其中主要成分为苯乙醇、二甲基三硫、棕榈酸甲酯、二甲基二硫等，分别占挥发性物质总量的53.94%、4.23%、3.88%和3.51%。图3，表1
2.3 挥发性物质纯品不同相态对苹果树腐烂病菌抑菌活性的影响
研究表明，筛选出9种化合物测试体外条件下的抑菌活性，分别为苯乙醇、二甲基三硫、二甲基二硫、3-羟基-2-丁酮、苯甲醇、愈创木酚、2，3-丁二醇、香叶基丙酮、1-辛醇。
2.3.1 挥发性物质气态熏蒸对苹果树腐烂病菌抑菌活性的影响
研究表明，不同浓度下，同种挥发性物质气态熏蒸对苹果树腐烂病菌的抑制率总体呈浓度依赖效应，即浓度越高，抑制率也越高。当浓度为500 μL/L，5种挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制率均达到了100%，分别为苯甲醇、愈创木酚、二甲基二硫、1-辛醇和二甲基三硫；随着浓度降低，大部分挥发性物质的抑菌效果也在降低，但愈创木酚、1-辛醇和二甲基三硫在浓度为62.50 μL/L时仍能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长。其次，苯甲醇对苹果树腐烂病菌的抑制效果较好，当浓度为62.50 μL/L时，抑制率为70.38%，仅次于3种效果最优的挥发性物质，而苯乙醇在相同浓度条件下对苹果树腐烂病菌的抑制率约为苯甲醇的50%（Plt;0.05）。当浓度为62.50 μL/L时，香叶基丙酮、二甲基二硫和2，3-丁二醇对苹果树腐烂病菌已无抑制效果，其中2，3-丁二醇在4个浓度条件下，气态熏蒸处理对苹果树腐烂病菌均没有抑制作用。3-羟基-2-丁酮对苹果树腐烂病菌的抑制作用相对较小，当浓度为62.50 μL/L时，抑制率仅为3.23%。表2
2.3.2 A144挥发性物质液态处理下苹果树腐烂病菌的抑菌活性变化
研究表明，随着浓度降低，同种挥发性物质液态直接接触抑菌率总体呈下降趋势。当挥发性物质为原液时，有6种挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制率均达到了100%，分别为香叶基丙酮、苯甲醇、愈创木酚、1-辛醇、二甲基三硫和苯乙醇；将原液稀释8倍后，1-辛醇和二甲基三硫仍能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长。其次，愈创木酚对苹果树腐烂病菌的抑制效果较好，当原液稀释8倍后，抑制率为87.63%，抑菌效果显著优于香叶基丙酮、苯乙醇和苯甲醇（Plt;0.05）。在4个浓度条件下，3-羟基-2-丁酮、二甲基二硫和2，3-丁二醇液态处理对苹果树腐烂病菌均无抑制作用。表3
3 讨 论
3.1 链霉菌挥发性物质抑菌活性及种类、含量
目前已报道多种链霉菌可以产生抑菌挥发性物质。小白链霉菌Streptomyces albulus挥发性有机物对核盘菌菌丝生长的抑制率为40.3%［21］。Li 等［22-23］报道，球孢链霉菌S. globisporusJK-1 接种麦粒后，产生的挥发性物质能有效抑制灰葡萄孢霉Botrytis cinerea和意大利青霉Penicillium italicum的菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长，有效抑制采后番茄灰霉病和砂糖橘青霉病。王小姣等［24］使用白刺链霉菌S. albospinus诱变菌株U-L-4产生的挥发性物质熏蒸处理黄瓜尖孢镰刀菌，病原菌菌落直径下降至3.5 cm，与对照相比抑制率达到53.2％。前期研究发现娄彻氏链霉菌A144菌株挥发性物质对Valsa mali的抑制率为22.87%［15］。
拮抗微生物挥发性物质的释放是动态的过程，随着微生物生长时间的延长，其产生的挥发性物质的种类和含量将发生变化［25］。经过平板对扣试验，在娄彻氏链霉菌A144菌株生长时间为20 d时，其产生的挥发性物质对Valsa mali的抑制率为100%，而当生长时期为30 d时，菌株A144产生的挥发性物质对Valsa mali已无抑制效果。挥发性物质的抑菌效果随着A144生长时间的延长呈先增强再减弱的趋势，张春慧［26］研究发现，当培养时间为8 d时，链霉菌TD-1产生的挥发性物质的对指示菌灰霉病菌的抑菌作用最强，抑菌率为45.92%，显著高于其他各组；培养4 d的链霉菌TD-1就开始产生挥发性抑菌物质，培养4～8 d的链霉菌TD-1产生的挥发性物质对灰霉病菌抑菌率逐渐增强，而后抑菌率逐渐减弱。
Wilkins等［27］通过 GC-FIC 和 GC-MS 测定了26种链霉菌产生的挥发性物质，通过保留指数和质谱的数据确定了120种挥发性物质，主要是烷类、烯烃类、醇类、酯类、酮类、含硫挥发性物质等。试验中通过GC-MS/MS测定生长至20 d的娄彻氏链霉菌A144挥发性物质有63种，其中苯乙醇占比最高，为53.94%，其次为二甲基三硫，占比为4.23%。吕昂［28］报道了将阳陵链霉菌S. yanglinensis3-10菌株接种于小麦粒培养物中，发现培养10 d 后其产生的挥发性物质对黄曲霉Aspergillus flavus菌落生长的抑制效果最佳，比对照组菌落直径减少38.19%；经气相色谱-质谱联用仪测定共产生了19种挥发性物质，含有醇类、酮类、萜类、有机酸酯类等，其中含量最高的挥发性物质为2-甲基异莰醇，且当该菌生长时间为10 d时产生的挥发性物质数量也是最多的。说明不同的链霉菌产生的挥发性物质种类和含量均有所差别，而生长时间也是其重要的影响因素之一。
3.2 挥发性物质气态和液态处理对苹果树腐烂病菌的抑菌效果
试验使用9种纯品验证挥发性物质气态熏蒸和液态直接接触对苹果树腐烂病菌的抑制效果。当挥发性物质浓度为62.5 μL/L（气态抑菌）和原液稀释8倍（液态抑菌）时，二甲基三硫和1-辛醇均能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长。已有报道二甲基三硫可以抑制多种病原菌，浓度为250 μL/L的二甲基三硫醚气态熏蒸完全抑制了苹果轮腐病菌Botryosphaeria dothidea的菌丝体生长［29］。二甲基三硫醚浓度在4.58 μL/L时对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides熏蒸处理后抑菌率达到50%，而浓度为12.69 μL/L时抑菌率达到95%［30］。1-辛醇作为生物熏蒸剂在防治植物病原菌中也展现出广阔的应用潜力。1-辛醇气态熏蒸和液体接触在低浓度下剂量依赖性地抑制黄曲霉孢子萌发和菌丝体生长。模拟贮藏试验表明，300 μL/L的1-辛醇熏蒸处理完全控制了含水量为 20%小麦、玉米中黄曲霉的生长［31］。
目前对愈创木酚抑制植物病原菌的研究较少。含有大量愈创木酚的植物提取物表现出抑菌作用［32-33］。挥发性物质浓度为62.5 μL/L时，愈创木酚气态熏蒸对苹果树腐烂病菌的抑制率为100%，原液稀释8倍后，液态直接接触处理对苹果树腐烂病菌的抑制率为87.63%，气态抑菌效果强于液态抑菌效果。气态抑菌和液态抑菌效果仅次于二甲基三硫和1-辛醇，说明愈创木酚在植物病原菌防治中具有很强的应用价值。苯乙醇是许多拮抗菌都会产生的挥发性物质［34-35］，当苯乙醇加入量为50 μL时，尖孢镰刀菌的菌落直径只有1.2 cm，气态熏蒸的抑菌率达到82.27%［36］。在最低浓度条件下，苯乙醇液态处理抑菌效果优于气态熏蒸处理，香叶基丙酮也是同样的结果，说明使用液体处理更能达到较好的抑制苹果树腐烂病菌的效果。3-羟基-2丁酮能够对番茄颈腐根腐病尖孢镰刀菌有明显的抑制作用［37］，但在试验研究中其气态熏蒸和液态直接接触的抑菌效果均表现微弱。二甲基二硫也是报道较多的抑菌挥发性物质［38-39］，研究中二甲基二硫液态处理无抑菌效果，当浓度为500 μL/L时，气态熏蒸对苹果树腐烂病菌的抑制率达到100%，浓度降低至62.5 μL/L时已无抑制效果，表明当二甲基二硫气态熏蒸时，比其液态处理时对苹果树腐烂病菌的抑制效果更好。
挥发性物质气态熏蒸处理适用于密闭空间，未来在温室大棚中苹果树苗木或盆景病害防治具有潜在的应用价值，将拮抗微生物自身或挥发性物质以间接熏蒸的方式作用于树体，预防和控制初期病害。李宝庆等［40］报道了枯草芽抱杆菌CAB-1对黄瓜白粉病具有较好的防治作用，防治效果为94.6%。因使用环境主要为相对密闭的温室大棚，推测挥发性物质在在其生防过程中可能起到了相对重要的作用。而液态处理适用于农药成分配制或与其它抗菌剂复配，应用于大田中的苹果树或其它果树、作物，直接作用于刮除苹果树病害组织处，达到治疗的作用。
4 结 论
当娄彻氏链霉菌A144生长20 d时，所产生的挥发性物质对苹果树腐烂病菌的抑制效果最佳，达到100%。菌株A144在不同生长时期共产生63种挥发性物质。当挥发性物质浓度为62.5μL/L（气态抑菌）和体积分数为12.5%（液态抑菌）时，二甲基三硫和1-辛醇均能完全抑制苹果树腐烂病菌的生长，挥发性物质单体化合物有潜力成为农药药剂来源。
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Inhibitory effect of different phases of Streptomyces rochei A144 volatile substances on Valsa mali var.mali
HUANG Wei1， WANG Ning1， SONG Bo2， WANG Suling1，QIN Xinzheng1， SONG Suqin1， LUO Yi1， WEI Zengzhou1， ZHANG Lijuan1，3， WANG Wei1
（1. Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology/Institute of Applied Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091，China; 2. Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091，China; 3.College of Grassland Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052，China）
Abstract：【Objective】 To investigate the inhibitory effect of volatile substances produced by Streptomyces rochei A144 on Valsa mali under different phases， and to detect and determine the volatile substance with antifungal activity in vitro. 【Methods】 The inhibitory effect of volatile substances of Streptomyces rochei A144 on apple tree rot at different growth stages （0， 10， 20， 25 and 30 d） was determined by plate coupling method， and the content of volatile substances was detected by headspace solid phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometry. After that， the volatile substances with good antibacterial activity under liquid and gas treatment were obtained by plate and coating method， respectively. 【Results】 When the growth time was 20 days， the inhibition rate of volatile substances produced by strain A144 was 100%. Strain A144 produced 63 volatile substances after 20 days of growth. When the concentration was 62.50 μL/L， the gas fumigation treatment of guaiacol， 1-octanol and dimethyl trisulfide could still completely inhibit the growth of apple tree rot. After diluting the original solution by 8 times， the liquid treatment of 1-octanol and dimethyl trisulfide with volume fraction of 12.5% could still completely inhibit the growth of apple tree rot. 【Conclusion】 The volatile substances 1-octanol and dimethyl trisulfide have the ability to significantly inhibit the pathogen of apple tree rot， and have the potential to be an important pesticide source of anti-apple tree rot.
Key words：Streptomyces rochei; growth time; volatile substances; Valsa mali
Fund projects：The Open Project of Key Laboratory of Xinjiang Uygur Autonomous Region （2020D04032）; Youth the Fund Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region （2022D01B172）; Innovation Ability Training Project for Young Sci-Tech Backbone Talents Sponsored by Xinjiang Academy of Agricultural Sciences （xjnkq-2023015 and xjnkq-2023013）
Correspondence author： ZHANG Lijuan （1986-）， female， from Shandong， associate researcher， research direction： microbial resources， （E-mail）532172011@qq.com
WANG Wei（1973-），female， from Xinjiang， researcher， research direction： microbial resources， （E-mail） mypony926@163.com
