摘 要：【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原，为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据 GenBank 数据库注册序列设计马铃薯Y病毒（Potato virus Y ，PVY）、马铃薯S病毒（Potato virus S，PVS）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）的检测引物，完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系（real-time fluorescent quantitative RT-PCR，RT-qPCR），其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，相关系数为99.42%以上，扩增效率均为84.48%以上，可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法，可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。
关键词：马铃薯；病毒病；实时荧光定量PCR
中图分类号：S436.3 文献标志码：A 文章编号：1001-4330（2024）10-2484-07
收稿日期（Received）：2024-04-12
基金项目：新疆维吾尔自治区重点研发项目“新疆马铃薯种质资源创新及脱毒种薯繁育技术研究与应用”（2022B02044-1）
作者简介：杨茹薇（1984-），女，宁夏灵武人，正高级农艺师，研究方向为植物保护，（E-mail）617950493@qq.com
通讯作者：刘易（1983-），男，河北保定人，研究员，研究方向为作物栽培育种，（E-mail）414002880@qq.com
0 引 言
【研究意义】马铃薯（Solanum tuberosum L）是茄科茄属一年生草本植物，其块茎可供食用［1］。目前我国马铃薯种植面积和产量均居世界第一［2］，2015年马铃薯已成为我国第四大粮食作物。马铃薯是一种产量较高的粮食作物。近年来马铃薯病毒病的波及范围在逐步扩大，制约了马铃薯产业的发展［3］。传统的防治技术主要包括有媒介昆虫防治、脱毒技术等等。这些技术在防治一般植物病毒病时起到了较好的效果［4］。侵染马铃薯最严重的三种病毒为PVY、PLRV、PVS，也是影响马铃薯生产的三种主要病毒［5］。【前人研究进展】传统病原菌检测法有两大类，一是病原学检测，如革兰氏染色法、形态结构观察法等，二是免疫学检测，有乳胶凝集试验、荧光免疫检测法等［6］。在植物病原体检测、监控病原物感染检测与分析中使用到该技术［7］。实时荧光定量RT-PCR在检测多种植物病毒中的灵敏度都达到了常规RT-PCR技术的 100 倍甚至更高［8-10］。目前，已经建立了 PVX（Potato virus X ，PVX）、PVY［11］、PVS［12］、马铃薯 A 病毒（Potato virus A，PVA）和 PLRV［13］的实时荧光定量PCR检测体系。【本研究切入点】实时荧光定量RT-PCR是在PCR反应时，利用荧光信号积累实时监测PCR产物生成，判断目标物是否存在。该检测技术的敏感性与特异性均非常强。而且可实现定量分析、实时分析。马铃薯病毒病是影响品种退化及产量下降的主要病害之一，需针对生产过程中马铃薯主要病毒病病原进行鉴定。【拟解决的关键问题】选用设计特异性强的实时荧光定量PCR检测引物，采集新疆主产区马铃薯病毒样本，建立3种高效的马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测方法，于新疆马铃薯主产区采样及检测马铃薯病毒病样，掌握马铃薯病毒病害的发生情况，为防控新疆主产区马铃薯病毒病提供重要科学依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
在新疆马铃薯主产区5个县采集疑似病毒病感染植株叶片。
仪器设备：Neofuge 13R高速冷冻离心机（上海力升科学仪器有限公司），电泳仪（美国Major science），EDC-810 PCR仪（北京东升生物技术有限公司），MA-6000荧光定量 PCR 仪（苏州雅睿生物科技有限公司）、超微量紫外分光光度计Nanodrop 2000（美国Thermo Scientinc Inc）等。检测试剂：检测试剂盒由上海派森诺生物科技股份有限公司提供、其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方 法
1.2.1 总RNA提取及cDNA提取合成
按照试剂盒说明书提取马铃薯叶片RNA，并将提取的RNA保存于-80℃，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA反转录，合成的cDNA保存于-20℃。
1.2.2 引物设计与合成
根据GenBank公布的3种马铃薯病毒基因序列，采用Primer premier 5.0软件设计引物。表1
1.2.3 引物特异性验证
提取马铃薯病毒病RNA，反转录成cDNA。以ddH2O为阴性对照，对引物进行常规RT-PCR、实时荧光定量PCR扩增，验证引物的特异性。
PCR反应体系为：2×easy Taq super Mix 10 μL，正向和反向引物（10 mmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O稀释至20 μL。反应程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35 个循环；72℃ 7 min并保存于4℃［14］。反应完成后，收集7 μL PCR产物，经1 ％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。120 V恒压电泳25 min后，在凝胶成像系统上检查结果并保存。
实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green Mix 10 μL，P1/P2 引物各 0.4 μL，cDNA 模板 1 μL，50 × ROX 参比染料 0.4 μL，ddH2O 稀释至 20 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。温度不断增长，将各个阶段荧光信号收集起来，建立熔解曲线。
1.2.4 检测灵敏度
将初始cDNA 模板稀释为10个浓度梯度，稀释倍数 10～1010，每个稀释梯度重复 3 次。并分别采用常规 RT-PCR 、实时荧光定量PCR 扩增法进行检测，基于扩增片段有无、荧光值大小来判断、分析引物对两种检测方法的敏感度。
1.2.5 标准曲线的建立
将阳性重组质粒cDNA梯度稀释10倍，用引物进行实时荧光定量PCR扩增。使用X轴上的质粒浓度对数和Y轴上的 Ct，生成实时荧光定量 PCR 标准曲线。
1.2.6 样本检测
从新疆马铃薯主产区采集疑似感染病毒叶片提取RNA，使用实时荧光定量PCR体系对每个样本进行病毒检测。
2 结果与分析
2.1 总RNA提取结果
研究表明，试剂盒提取的RNA中28s和18s两条亮带最亮，5 s条带较浅，无明显拉伸，即表示提取的RNA未降解，较为完整。另有检测结果表明，试剂盒提取的RNA质量符合后续逆转录反应的模板质量要求。图1
2.2 检测灵敏度及准确度
研究表明，当初始模板浓度很低时，3个马铃薯病毒基因仍然具有良好的扩增效率，且灵敏性都比较强。基线平坦、斜率大、无异常扩增。各扩增产物的溶解曲线仅显示单峰，不存在引物二聚体及非特异性扩增。图2，图3
2.3 引物特异性检测
研究表明，将提取的总RNA作为模板进行反转录反应，用PVY、PVS、PLRV三种特异性引物分别进行PCR扩增反应。设计的3对引物可以扩增目的片段，初步判断扩增出了PVY、PVS、PLRV目的基因，可用于实时荧光定量PCR检测。图4
2.4 标准曲线的建立
将质粒标准品梯度稀释10倍进行实时荧光定量PCR扩增，绘得标准曲线。3种标准曲线方程的R2均接近1，即表示在测定浓度范围，阳性质粒拷贝数与对应Ct值线性均具有较强线性相关性，可用于检测随后样品中病毒拷贝量的数量。图5，表2
2.5 不同患病植株检测结果
研究表明，PVY样本每毫升RNA中病毒拷贝数从高到低依次为QT-58、QT-61、BLK-87，其相对表达量分别为1203.03 copies/μL、1198.05 copies/μL、1170.87 copies/μL，与其余样本存在显著差异。样本ZP-6显著性高于其它16个样本，其PVS相对表达量为622.49 copies/μL，样本QT-23和QT-28与QT-19、QT-17样本无显著差异。PLRV样本每毫升RNA中病毒拷贝数从高到低依次为QT-9、QT-12、QT-17，其相对表达量分别为128.78、71.26和49.8 copies/μL，染病程度QT-9﹥QT-12﹥QT-17。样品QT-9显著性高于其它5个样本，样本QT-12和QT-17、QT-20、QT-21样本之间无显著差异。图6～8
3 讨 论
3.1 马铃薯病毒病在我国各个产区均有发生，已感染病毒的植株可通过无性繁殖世代积累及传递，因无特效化学药剂防治，又因不同病毒可在植株上引起相似的症状，而在不同条件下同种病毒引起的症状又有所差异，病害田间诊断困难，反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术已研究的较成熟［15-18］。应用实时荧光定量PCR技术达到快速检测马铃薯病毒病的技术，对样本的含毒量要求低，不仅可以定性还能定量分析［14］，可准确、及时进行植株早期检测诊断［19］。
3.2 实时荧光定量PCR分子检测技术可用于检测多种不同病原菌。陈兆贵等［20］建立的马铃薯卷叶病毒Actin 管家基因实时荧光定量PCR 体系在病毒 cDNA 稀释 100 倍以后仍然可以灵敏的检测出来；张永江等［21］基于马铃薯病毒外壳蛋白基因的保守核苷酸序列设计了用于病毒检测的引物，可检测 36 pg/μL的总RNA。研究建立了3种马铃薯病毒病的实时荧光定量检测体系对PVY、PVS、PLRV 3种病毒实现灵敏、精准、特异且快速的检测。
4 结 论
引入实时荧光定量PCR检测系统对3种马铃薯病毒病进行实时PCR扩增，均具有基线平坦、斜率大、重复性好、灵敏度高等优点。该检测体系可以在分子水平上检测出马铃薯植株中存在的3种病毒（PVY、PVS、PLRV）。该检测体系对于马铃薯病毒含量可以迅速且准确的检测，应用该体系还可以定量分析病毒基因表达。马铃薯病毒病早期监测可以充分利用该检测体系。
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Research on real-time fluorescence quantitative PCR detection of potato virus disease
YANG Ruwei， LIU Yi， Gulimila Rehemutula，SUN Hui，JIANG Yinghong
（Comprehensive Experimental Farm，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830012，China）
Abstract：【Objective】 Potato virus disease is one of the major diseases affecting the degradation of varieties and the decline of yields， and it is necessary to characterize the major virus pathogens of potato in the production process， so as to provide a scientific basis for the scientific prevention and control of potato virus diseases. 【Methods】 The primers for potato virus Y （PVY）， potato virus S （PVS） and potato leaf roll virus （PLRV） were designed according to the sequences registered in the GenBank database， and the primer concentration and system optimization were completed. 【Results】 A real-time fluorescent quantitative RT-PCR （RT-qPCR） system was established for the detection of three potato virus diseases， and the standard curve showed a good linear relationship between the cycling threshold and the template concentration， with a correlation coefficient of 99.42%， and an amplification efficiency of 84.48%. The amplification efficiencies were all 84.48%， which could rapidly and accurately detect the three potato viruses. 【Conclusion】 Real-time fluorescence quantitative PCR is a highly sensitive and specific detection method， which can be used to monitor the infection of virus diseases in potato production in real time.
Key words：potato; virus disease; real-time fluorescence quantitative PCR
Fund projects：Key Ramp;D Projects in the Autonomous Region \" Potato Germplasm Resource Innovation and Breeding Technology Of detoxified Seed Potato Research and Application In Xinjiang\"（2022B02044-1）
Correspondence author： LIU Yi （1983-）， male， from Baoding，Hebei， researcher， research direction： Crop cultivation and Breeding， （E-mail）414002880@qq.com
