摘 要:【目的】分析COIL及BMPR-IB基因与产羔数关联性,探究多浪羊与湖羊(简称多湖杂交)后代产羔性状COIL及BMPR-IB基因的遗传效应。
【方法】研究以多浪羊与湖羊级进杂交F1代、F2代、F3代为研究对象,随机选取多湖杂交F1代(228只)、F2代(254只)、F3代(252只),进行全血DNA提取,COIL基因利用扩增阻滞突变系统PCR(ARMS-PCR)技术基因分型、BMPR-IB基因利用限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-RFLP)基因分型后,与产羔数关联分析。
【结果】在多湖杂交F1代中,突变纯合GG型产羔数极显著高于突变杂合CG、野生CC型产羔数(Plt;0.01),突变杂合CG型产羔数极显著高于野生CC型产羔数(Plt;0.01);在多湖杂交F2代中突变纯合GG型与突变杂合CG、野生CC型产羔数间均差异极显著(Plt;0.01);在多湖杂交F3代中,突变纯合GG、突变杂合CG型产羔数极显著高于CC型(Plt;0.01),GG型产羔数极显著高于CG型(Plt;0.05)。在多湖杂交F1、F2、F3代中均为突变纯合BB型产羔数极显著高于突变杂合B+型、野生++型产羔数(Plt;0.01),突变杂合B+型产羔数极显著高于野生++型产羔数(Plt;0.01)。
【结论】COIL基因与BMPR-IB基因均对多湖杂交后代产羔数影响显著,但BMPR-IB基因在多湖杂交后代突变率较低,可能不适合作为筛选多湖杂交双羔群体的关键基因,COIL基因可以作为筛选多湖杂交高繁殖率的新候选基因。
关键词:多浪羊;湖羊;杂交;产羔性状;COIL基因;BMPR-IB基因;遗传效应
中图分类号:S826.6 ""文献标志码:A
文章编号:1001-4330(2025)01-0243-08
收稿日期(Received):
2024-08-06
基金项目:
国家重点研发项目“南疆地方肉羊选育关键技术研究与示范”(2021YFD1600702-1)
作者简介:
史香云(1998-),女,江苏溧阳人,硕士研究生,研究方向为动物遗传育种与繁殖,(E-mail)137469496@qq.com
通信作者:
刘玲玲(1988-),女,安徽蚌埠人,副教授,研究方向为动物遗传育种与繁殖,(E-mail)673834944@qq.com
刘武军(1966-),女,河南鹿邑人,教授,博士,硕士生/博士生导师,研究方向为动物遗传育种与繁殖,(E-mail)lwj_ws@163.com
0 引 言
【研究意义】我国羊肉产量连续多年居世界首位[1]。多浪羊是新疆本地优良肉用绵羊品种,具有体型大、生长速度快、产肉率高、肉品质好等特点,但其繁殖力较低[2, 3]。而湖羊是我国优良的多胎绵羊品种,具有常年发情、产羔率高等繁殖特点[4, 5]。【前人研究进展】马海玉[6]在多浪羊群体研究中,COIL基因g.7321466Ggt;C位点,GG型、CG型平均产羔数与CC型平均产羔数存在显著差异。【本研究切入点】姚东等[7]对东湖杂交F1代的研究中,BMPR-1B基因fecb位点突变纯合产羔数显著高于野生型产羔数。需将多浪羊与湖羊杂交,其后代杂种优势可发挥多浪羊与湖羊的品种优势,在保证其肉用性能的情况下提升杂交后代的繁殖能力。【拟解决的关键问题】通过利用扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System-PCR , ARMS-PCR)技术检测多湖杂交后代COIL基因,利用限制性内切酶片段长度多态性技术(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism , PCR-RFLP)检测多湖杂交后代BMPR-IB基因,分析2个候选基因在不同杂交后代的遗传效应,为选育高繁殖率多湖杂交优良后代提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 动 物
多浪公羊与湖羊母羊杂交产多湖F1代(228只)、多浪公羊与湖羊母羊级进F2代(254只)、多浪公羊与湖羊母羊级进F3代(252只)为研究对象(新疆阿克苏地区温宿叱石成羊畜牧有限公司)。试验期间饲养管理条件相同。
1.1.2 血液采集
每只羊颈静脉采血5 mL,保存于EDTA抗凝采血管中,采血后颠倒混匀以防止血液凝固,放置于-20℃冷冻保存。
1.1.3 血液基因组DNA提取
使用福际全血基因组DNA提取试剂盒提取,严格按照试剂盒说明书操作,使用1% 浓度的琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段的质量进行检测。
1.2 方 法
1.2.1 COIL基因PCR扩增及检测
根据筛选到的COIL基因g.7321466Ggt;C,序列号NC_019468.2在线NCBI网络平台设计引物,突变位置参考绵羊基因组版本号Oar_v4.0,由上海生物工程技术有限责任公司合成。
上游内引物Fi为:AGACTCAGACTCCGAGGAGGAATGGC;上游外引物Fo为:CTGGAAGATGATGTTCTGGAGGTCTTGC;下游内引物Ri为:CATGGTCGTCCGTACAAAAGACAGACC。下游外引物Ro为:AAATCGCCAAAGAAG AAGGAGAAACGTG。扩增受阻突变体系PCR反应体系为20 μL:2×Taq" PCR Master mix 10 μL,ddH2O 4 μL,上游外引物Fo 0.4 μL,下游外引物Ro 0.4 μL,上游内引物Fi 1.6 μL,上游外引物Ri 1.6 μL,DNA 2 μL。表1
1.2.2 "BMPR-IB基因PCR扩增及检测
BMPR-IB基因参考文献[8]设计的,由上海生物工程技术有限责任公司合成,上游引物F为:GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG,下游引物R为:CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC。PCR反应体系为20 μL:2×Taq" PCR Master mix 10 μL,ddH2O 7 μL,上游引物F 0.5 μL,下游引物R 0.5 μL,DNA 2 μL。表2
1.3 数据处理
利用编写的Excel函数对收集到的生产数据、试验数据进行统计处理(基因型频率、等位基因频率),并检验是否符合哈代-温伯格平衡原理(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)。采用SPSS25.0中单因素方差分析对遗传多态性与相应羊产羔数之间的关系进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 多湖杂交基因组DNA提取结果
研究表明,提取的多湖杂交后代基因组DNA在1% 琼脂糖凝胶电泳后成像片段清晰,无拖尾,符合要求可以进行下一步试验。图1
2.2 COIL基因的ARMS-PCR扩增产物检测
研究表明,1号泳道为野生型CC基因型,2、3、4号泳道为突变杂合CG基因型,5号泳道为突变纯合GG型;2号泳道为野生型CC基因型,1、3、4号泳道为突变杂合CG基因型,5号泳道为突变纯合GG型;4、5号泳道为野生型CC基因型,1、3号泳道为突变杂合CG基因型,2号泳道为突变纯合GG型;条带清晰、且片段大小正确、分型成功。图2~4
2.3 BMPR-IB基因的PCR扩增产物检测
研究表明,目标片段扩增特异性良好,得到140 bp大小目标片段,无其他杂带,可用作后续试验。图5
2.4 BMPR-IB基因的PCR-RFLP检测
研究表明,2、4、5号泳道为野生型++基因型,3、6号泳道为突变杂合B+基因型,1号泳道为突变纯合BB基因型;1、4、5号泳道为野生型++基因型,2号泳道为突变杂合B+基因型,3号泳道为突变纯合BB基因型;1、3、4号泳道为野生型++基因型,5号泳道为突变杂合B+基因型,2号泳道为突变纯合BB基因型;条带清晰、且片段大小正确、分型成功。图6~8
2.5 多湖杂交后代遗传参数计算
研究表明,COIL基因在多湖杂交后三代中均检测出三种基因型,分别为野生型CC基因型、突变杂合CG基因型、突变纯合GG基因型;G等位基因在多湖F1代占到59.6% 、多湖F2代占到61.6% 、多湖F3代占到63.7% ,在三代中均为优势等位基因。BMPR-IB基因在多湖杂交后三代中均检测出三种基因型,分别为野生型++基因型、突变杂合B+基因型、突变纯合BB基因型;+等位基因在多湖F1代占到64.2% 、多湖F2代占到63.7% 、多湖F3代占到63.2%,在三代中均为优势等位基因。COIL及BMPR-IB基因在在杂交后三代中均中处于Hardy-Weinberg不平衡状态。表3~4
2.6 多湖杂交后代中相同代数、不同基因型与产羔数的关联分析
研究表明,在多湖杂交F1代中,突变纯合GG型产羔数极显著高于突变杂合CG、野生CC型产羔数(Plt;0.01),突变杂合CG型产羔数极显著高于野生CC型产羔数(Plt;0.01);在多湖杂交F2代中突变纯合GG型与突变杂合CG、野生CC型产羔数间均差异极显著(Plt;0.01);在多湖杂交F3代中,突变纯合GG、突变杂合CG型产羔数极显著高于CC型(Plt;0.01),GG型产羔数极显著高于CG型(Plt;0.05);COIL基因g.7321466Ggt;C位点与绵羊产羔数关联分析表明,多湖杂交后代突变纯合会增加产羔数。表5
研究表明,在多湖杂交F1、F2、F3代中均为:突变纯合BB型产羔数极显著高于突变杂合B+型、野生++型产羔数(Plt;0.01),突变杂合B+型产羔数极显著高于野生++型产羔数(Plt;0.01);多湖杂交后代突变纯合会增加产羔数。表6
2.7 多湖杂交后代中不同代数、相同基因型与产羔数的关联性
研究表明,在野生型(CC型)中,多湖杂交F1、F2、F3代间产羔数均差异不显著(Pgt;0.05);在突变杂合型(CG型)中,多湖杂交F3代产羔数极显著高于F2、F1代产羔数(Plt;0.01),F2代产羔数极显著高于F1代产羔数(Plt;0.01);在突变纯合型(GG型)中,多湖杂交F3代产羔数显著高于多湖杂交F1(Plt;0.05),多湖杂交F2代与F3代、F1代差异不显著(Pgt;0.05)。随着代数的增加产羔数逐渐增多。表7
研究表明,在野生型(++型)中,多湖杂交F3代产羔数极显著高于F2、F1代产羔数(Plt;0.01),F3代产羔数极显著高于F2代产羔数(Plt;0.01);在突变杂合型(B+型)中,多湖杂交F3代产羔数极显著高于F2、F1代产羔数(Plt;0.01),F2代产羔数极显著高于F1代产羔数(Plt;0.01);在突变纯合型(BB型)中,多湖杂交F1、F2、F3代间产羔数均差异不显著(Pgt;0.05)。随着代数的增加产羔数也逐渐增多。表8
3 讨 论
3.1 COIL基因对绵羊产羔数的影响
coilin是Cajal小体的特征性蛋白,在小核糖核蛋白(RNP)形成过程中发挥重要作用[9]。coilin在动植物中维持Cajal小体平衡中起着重要作用。coilin已成为用于鉴定脊椎动物细胞中Cajal小体的主要分子标记[10]。
马海玉[6]在多浪羊群体研究中,COIL基因g.7321466Ggt;C位点,GG型、CG型平均产羔数与CC型平均产羔数存在显著差异。黄开飞等[11]在阿勒泰羊群体研究中,COIL基因与产羔数关联分析突变纯合型与突变杂合型产羔数极显著高于野生型产羔数,突变纯合型产羔数显著高于突变杂合型产羔数,与试验研究的多湖杂交F3代产羔数关联分析结果一致。王琼等[12]在阿勒泰羊群体中基因多态性与黄开飞等[11]一致,但产羔数关联分析无显著差异,可能受到了样本量或者采集群体的影响。而王琼等[12]在吐鲁番黑羊群体研究中,COIL基因g.7321466Ggt;C位点产羔数均无显著相关;马海玉[6]在和田羊、策勒黑羊两个群体中,平均产羔数均为CC型显著高于CG型、GG型,这可能与样本品种有关。
3.2 BMPR-IB基因对绵羊产羔数的影响
骨形态发生蛋白受体IB(bone morphogenetic protein receptor IB, BMPR-IB)是生长因子β基因家族中的亚家族成员,在动物生殖系统发育与多胎性能中发挥着非常重要的作用,是目前发现的与羊繁殖力相关的重要的候选基因[13]。
喇永富等[14]发现湖羊群体中存在BB、B+、++三种基因型,藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊群体中仅存在B+和++2种基因型,多浪羊群只有++基因型,并且在四种绵羊品种中BB、B+基因型的个体产羔数量高于++基因型的个体,BB、B+基因型的个体间没有明显的差别。牛志刚等[15]在多浪羊中利用PCR-RFLP技术对BMPR-IB基因进行分型B+基因型只有0.036,其余都是++型,突变程度低。姚东等人[7]对东湖杂交F1代的研究中,BMPR-1B基因fecb位点突变纯合产羔数显著高于野生型产羔数。
试验对多湖杂交F1代、F2代、F3代的多态性及其对应产羔数进行关联分析结果显示,BMPR-IB基因在多湖杂交后代中突变纯合会增加产羔数,且随代数的增加产羔数也逐渐增多,但突变程度低。在多湖杂交后代中BMPR-IB基因可能不适合用作为筛选双羔群体的关键基因。
3.3 杂交对绵羊产羔数的影响
利用杂种优势培育出适合推广的目标畜禽品种是现代化畜禽养殖业提升市场竞争力的主要手段[16]。郭琐鑫[17]对多湖杂交的研究中,多湖杂交F1代产羔率显著高于多浪羊产羔率,成活率显著高于湖羊及多浪羊成活率。萨福克公羊、多浪羊母羊进行杂交,其产羔率达149%,说明萨多杂交遗传了母本的多胎性状[18]。杜泊羊与湖羊在小群自然交配情况下,后代产羔率达244%,公、母羊均表现出良好的繁殖效果[19]。乌骨羊与湖羊杂交后代产羔率较纯繁乌骨羊产羔率提升了72.5%[20]。李丹妮[21]在东弗里生羊与湖羊杂交的试验中,东湖杂交F2代产羔率显著提升,达189.51%。
通过导入湖羊多胎基因来提升其他品种产羔率已成为主流趋势。试验中,COIL基因g.7321466Ggt;C位点、BMPR-IB基因Fecb位点与绵羊产羔数关联分析表明,多湖杂交后代突变纯合会增加产羔率,多湖杂交F3代产羔率显著高于多湖杂交F2代、F1代产羔率,说明通过级进杂交方式多湖杂交后代产羔率显著提升。
4 结 论
COIL基因与BMPR-IB基因在多浪羊与湖羊杂交后代中均成功分型三种基因型,与产羔数关联分析表明,COIL基因与BMPR-IB基因均对多湖杂交后代产羔数影响显著,但BMPR-IB基因在多湖杂交后代突变率较低,不适合作为筛选多湖杂交双羔群体的关键基因,COIL基因可以作为筛选多湖杂交高繁殖率的新候选基因。且可以选留COIL基因突变纯合型(GG型)及突变杂合型(CG型)作为后续多湖杂交F4代母本,可显著提高G等位基因频率。
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Analysis of genetic effects of COIL and BMPR-IB genes for lambing
traits in Duolang sheep and Hu sheep crossbred sheep
SHI Xiangyun1, LI Jiaozhi2, LIU Lingling1, LIU Wujun1
(1. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Wensu Chishichengyang Husbandry Co., Ltd., Wensu Xinjiang 843100, China)
Abstract:【Objective】 This study aims to investigate the genetic effects of lambing traits COIL and BMPR-IB genes in the offspring of Duolang sheep and Hu sheep crossbreeding (Duohu sheep crossbreeding) cascade crosses by analyzing the association between COIL and BMPR-IB genes and the number of lambs produced.
【Methods】" Randomly selected F1 (228), F2 (254), and F3 (252) generations of Duohu crossbred sheep were subjected to whole blood DNA extraction, and the COIL gene was genotyped using amplification refractory mutation system-PCR (ARMS-PCR) technique, and the BMPR-IB gene was analyzed in association with the number of lambs produced after genotyping using PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) technique.
【Results】 In the Duohu F1 sheep, the lambing numbers of the mutant pure GG type were significantly higher than those of the mutant heterozygous CG and the wild CC type (Plt;0.01), and that of the mutant heterozygous CG type were significantly higher than that of the wild CC type (Plt;0.01); in the Duohu F2 sheep, the differences between the number of lambs produced by the mutant pure GG type and the mutant heterozygous CG and wild CC types were all highly significant (Plt;0.01); in the Duohu F3 sheep, the number of lambs produced by the mutant pure GG and the mutant heterozygous CG types was highly significantly higher than that of the CC type (Plt;0.01), and the number of lambs produced by the GG type was highly significantly higher than that of the CG type (Plt;0.05). In the Duohu F1, F2 and F3 sheep, the numbers of lambs produced by the mutant pure BB type were highly significantly higher than the number of lambs produced by the mutant heterozygous B+ type and the wild++ type (Plt;0.01), and the number of lambs produced by the mutant heterozygous B+ type was highly significantly higher than that of the wild++ type (Plt;0.01).
【Conclusion】 Both COIL gene and BMPR-IB gene have significant effect on lambing number of Duo and Hu crossbred sheep. However, the BMPR-IB gene has a low mutation rate in the progeny of Duohu sheep, which may not be suitable as a key gene for screening the double lambing population of Duohu sheep, and the COIL gene can be a new candidate gene for screening the high reproduction rate of Duohu sheep.
Key words:Duolang sheep;Hu sheep;crossbreed; lambing traits; COIL gene; BMPR-IB gene; genetic effects
Fund projects:National Key Ramp;D Program Project “R amp; D of Key Technologies for Selection and Breeding of Local Meat Sheep in Southern Xinjiang” (2021YFD1600702-1)
Correspondence author: LIU Lingling (1988-) , female, from Bengbu,Anhui, associate professor, research direction: animal genetic breeding and reproduction, (E-mail)673834944@qq.com
LIU Wujun(1966-) , female, from Luyi, Henan, professor,Ph.D., master and doctorals supervisor, research direction: animal genetic breeding and reproduction, (E-mail)lwj_ws@163.com