摘 要：【目的】探究棉花耐受盐碱胁迫的机制，为提高新疆盐碱地棉花产量提供依据。
【方法】以棉花为材料，设置对照（CK）、盐胁迫（NaCl，CS）和碱胁迫（NaHCO3+Na2CO3，AS）3个处理，采用TMT技术分析盐胁迫和碱胁迫下棉花根系中蛋白表达的变化，对筛选出的差异蛋白进行生物信息学分析。
【结果】盐胁迫下根中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和柠檬酸合酶活性分别显著降低12.0%、9.9%、9.7%和32.8%，碱胁迫下根中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和谷草转氨酶活性分别显著增加10.9%、5.9%、10.4%、45.1%、26.3%和23.4%。在盐胁迫下共筛选出1 725个差异蛋白，包括508个上调差异蛋白和1217个下调差异蛋白，其中能量代谢有10个上调差异蛋白、43个下调差异蛋白，氨基酸代谢有14个上调差异蛋白、76个下调差异蛋白，遗传信息处理有45个上调差异蛋白、84个下调差异蛋白，信号传导有13个上调差异蛋白、29个下调差异蛋白；在碱胁迫下共75个差异蛋白，包括30个上调差异蛋白和45个下调差异蛋白，其中能量代谢只有2个下调差异蛋白，氨基酸代谢1个上调差异蛋白、3个下调差异蛋白，遗传信息处理和信号传导中未筛选出差异蛋白。
【结论】盐胁迫显著抑制棉花根系中的能量代谢，氨基酸代谢，遗传信息处理和信号传导，碱胁迫对遗传信息处理和信号传导无显著影响。
关键词：盐胁迫；碱胁迫；棉花；蛋白质组；氨基酸代谢；能量代谢
中图分类号：S562 ""文献标志码：A
文章编号：1001-4330（2025）01-0146-15
收稿日期（Received）：
2024-07-25
基金项目：
国家自然科学基金项目（32160742）；农业农村部西北绿洲农业环境重点实验室开放基金（XBLZ-20214）；石河子大学青年创新人才培养计划（CXPY202111）；石河子大学高层次人才科研启动资金专项（RCZK202017）
作者简介：
孙彩琴（2001-），女，甘肃通渭人，本科生，研究方向为土壤肥力与调控，（E-mail） scaiq0927@163.com
通信作者：
郭慧娟（1989-），女，河南扶沟人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为植物抗逆营养生理及其分子生物学，（E-mail） guohjmw@163.com
0 引 言
【研究意义】盐胁迫是常见的非生物胁迫之一［1-2］。棉花被认为是耐盐作物，但其生长仍受盐碱胁迫的抑制。尤其在新疆棉花生产受盐碱胁迫的限制更加明显［3］。新疆盐渍土面积占新疆耕地总面积的37.72%［4］。盐胁迫诱导的渗透和离子胁迫会破坏植物的细胞和代谢途径，从而影响其生长和发育，而发芽和早期幼苗阶段被认为是植物生命周期中的敏感阶段［5］。探究棉花苗期根系对不同盐碱胁迫的响应，对提高盐碱地棉花产量有实际意义。【前人研究进展】定量蛋白质组分析可鉴定复杂混合物中的蛋白质以及定量其丰度，从而深入了解耐盐机制［6］。根系是植物感知多种胁迫伤害的首要部位，探究根对盐碱胁迫的响应机制具有重要意义。关于水稻［7-8］，大豆［9］，小麦［10］和拟南芥［11］等作物在盐碱胁迫下的蛋白质组响应机制研究已有很多，对于棉花的研究则较为鲜见。研究发现，盐碱胁迫不仅能引起植物蛋白质丰度的变化［12］，还会影响抗氧化防御体系的活性、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的降解以及热激蛋白类分子的表达［13］。两类基因参与盐胁迫响应，一类基因主要编码控制代谢物形成的相关蛋白质基因，维持代谢和渗透的平衡，另一种类型编码与信号受体和转导相关的蛋白质，以确保植物中的正常信号转导［5，14］。有机酸、氨基酸、甜菜碱、糖和醇等有机小分子物质在盐碱胁迫下显著积累，有助于作物耐受盐碱胁迫造成的渗透胁迫［15］，盐碱胁迫下氨基酸代谢、碳水化合物代谢、β氧化，糖酵解和TCA循环明显增强，其强度增加对作物适应盐碱胁迫至关重要［16-17］，棉花适应盐碱胁迫的代谢机制存在一定差异，与盐胁迫相比，促进根系中有机酸的积累和代谢，抵消碱胁迫下高pH值的负面影响是棉花耐受碱胁迫的关键机制［18］。【本研究切入点】关于棉花蛋白质组对盐碱胁迫的响应信息还尚不明确。需采用TMT标记定量技术，鉴定不同盐碱胁迫下棉花根系的蛋白质组谱。【拟解决的关键问题】从蛋白质组学的角度探究棉花对盐碱胁迫的耐受机制，为合理利用新疆盐碱地提高棉花产量提供参考。
1 材料与方法
1.1 材 料
于2022年在石河子大学农学院试验站温室进行（44°18′52″N，86°3′23″E）土柱试验。供试土壤采自石河子大学农学院试验站，土壤类型为灌耕灰漠土，质地为壤土。土壤基础理化性质如下：有机质14.5 g/kg，全氮1.2 g/kg，速效磷11.6 mg/kg，速效钾255 mg/kg。供试棉花品种为鲁棉研24号。
1.2 方 法
1.2.1 试验设计
通过向供试土壤中添加NaCl和Na2CO3+NaHCO3，设置3种盐碱胁迫类型：（1）对照-非盐碱土壤（CK）；（2）NaCl盐土（CS）；（3）Na2CO3+NaHCO3碱土（AS），每个处理重复3次。
在试验开始前，将供试土壤自然风干，碾碎后过2 mm筛。将NaCl，Na2CO3+NaHCO3（重量比1∶1）溶液加入供试土壤至饱和状态（对照加同体积去离子水），放置1个月使土壤达到平衡，至此形成供试盐渍土。再将处理后土壤风干，碾碎后过筛，取样测定含盐量、电导率、pH值。表1
棉花土柱模拟试验用高60 cm，直径35 cm的圆柱容器，底部密封；按容重1.25 g/cm3分层装土50 cm，每10 cm一层，每个土柱装风干土60 kg。灌水方式为滴灌，毛管平铺在土柱上方，滴头固定在土柱顶中心位置，每个土柱由1个滴头供水，灌水量2.5 L/pot。2022年4月10日播种，每个土柱播种20株，采用干播湿出，幼苗生长至2片真叶时，每个土柱定植4株棉花。试验期间采用滴灌的方式定期补充水分，使土壤含水量保持在田间持水量的60%～80%。试验在播种后60 d结束。
1.2.2 样品采集与处理
苗期采集样本（棉花长至8片真叶时），从每个处理选取9株有代表性的棉花植株，其中3株用于测定酶活性，另外6株用于蛋白质组。以子叶节作为根和茎的分界点，将植株分为根、茎和叶三部分，分别将棉株的根和倒三叶在液氮中冷冻干燥，用于蛋白质组学分析，每个处理设6个生物学重复，使用植物研磨机（Scientz-48，北京同元聚物科技有限公司）研磨成粉末，并储存在-80℃备用。
1.2.3 测定指标
1.2.3.1 酶活性
选取棉花倒三叶测定：己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、柠檬酸合酶（CS）、苹果酸脱氢酶（MDH）、谷氨酸脱氢酶（GLDH）和谷草转氨酶（AST）使用检测试剂盒测定。
1.2.3.2 蛋白组
蛋白提取：取0.4 g样品至2 mL EP管中，加入800" μL 酚提取液混匀，混匀低温研磨4 min；加入 800" μL Tris-平衡酚试剂；反应40 min，每 5 min震摇1次； 7 200 r/min，4℃离心 10 min；转移上清至新的EP管中；加入4倍体积甲醇-乙酸铵，-20℃沉淀过夜；12 000 r/min，4℃离心10 min，收集沉淀；加入500" μL甲醇清洗，12 000 r/min，4℃离心10 min，去除上清，步骤重复1次；加入500" μL丙酮清洗，12 000 r/min，4℃离心 10 min，去除上清；待丙酮挥发干，加入 500" μL RIPA裂解液复溶，打散沉淀，静置1 h； 12 000 r/min，4℃离心 10 min，取上清。
1.2.3.3 蛋白质检测
每个样品取2" μg 总肽，经 nano-UPLC 液相系统 EASY-nLC1200 进行分离后联用配备纳升离子源的质谱仪（Q Exactive HFX）采集数据。色谱分离采用 100" μ ID ×15 cm 反相色谱柱（Reprosil- Pur 120 C18-AQ，1.9" μm，Dr.Maisch）进行。流动相采用乙腈-水-甲酸体系，其中流动相 A 为0.1%甲酸-98%水溶液（乙腈为 2%），B 相为 0.1%甲酸-80% 乙腈溶液（水为 20%）。色谱柱以 100% 的 A 相平衡后，样品由自动进样器直接上样到色谱柱，再经色谱柱梯度分离，流速 300 nL/min，梯度时长 90 min。流动相 B比例：2%～5% 持续 2 min，5%～22% 持续 68 min，22%～45% 持续 16 min，45%～95% 持续 2 min，95% 持续 2 min。
1.3 数据处理
数据采用Excel 2016软件处理，使用SPSS 17.0软件进行统计分析，差异显著性检验采用Duncans法（P＜0.05）。基于基因本体（GO）富集分析（http：//www.geneontology.org/）进行差异表达蛋白的功能分类。使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库 （https：//www.genome.jp/kegg/）对差异表达蛋白进行途径富集分析。
2 结果与分析
2.1 棉花根系中差异蛋白的筛选与鉴定
研究表明，前两个主成分分别解释了63.4%和7.2%的差异。第一主成分主要差异蛋白为A0A7J9KU19、A0A7J9KWS7、A0A7J9KP92、A0A7J9NBA4和A0A7J9KMI6。第二主成分主要差异蛋白为A0A7J9KV60、A0A7J9MSF9、A0A7J9M168、A0A7J9MQC0和A0A7J9N4W5。图1
在CS根中共检测到5 648个蛋白，其中508个蛋白显著上调，1 217个蛋白显著下调，3 743个蛋白无显著变化；在AS根中共检测到5 649个蛋白质，其中30个蛋白显著上调，45个蛋白显著下调，5 574个蛋白无显著变化。图2
2.2 差异蛋白的亚细胞定位
研究表明，在CS根中，细胞质中有578个差异蛋白，占总数的33.51%；细胞核中有300个差异蛋白，占总数的17.39%；分泌蛋白中有291个差异蛋白，占总数的16.87%；叶绿体中有140个差异蛋白，占总数的8.12%；线粒体中有99个差异蛋白，占总数的5.74%；内质网膜中有72个差异蛋白，占总数的4.17%；细胞质膜中有56个差异蛋白，占总数的3.25%；内质网中有47个差异蛋白，占总数的2.72%；高尔基体膜中有39个差异蛋白，占总数的2.26%；线粒体膜中有20差异蛋白，占总数的1.16%。
在AS根中，分泌蛋白中有24个差异蛋白，占总数的32%；细胞质中有20个差异蛋白，占总数的26.67%；叶绿体中有11个差异蛋白，占总数的14.67%；细胞核中有9个差异蛋白，占总数的9.12%；内质网膜中有4个差异蛋白，占总数的5.33%；内质网中有2个差异蛋白，占总数的2.67%；线粒体中有2个差异蛋白，占总数的2.67 %；过氧化物酶体中有2个差异蛋白，占总数的2.67%；细胞质膜中1个差异蛋白，占总数的1.33%。图3
2.3 差异蛋白的GO注释富集
研究表明，盐胁迫下，在细胞组分中多数差异蛋白注释的条目为细胞内、细胞质、细胞质组分和含蛋白质复合物，在分子功能中多数差异蛋白注释的条目为催化活性、水解酶活性（作用于酸酐）、焦磷酸酶活性和水解酶活性（作用于酸酐，在含磷的硝酸盐中），在生物过程中多数差异蛋白注释的条目为有机氮化合物生物合成工艺、小分子代谢过程、细胞酰胺代谢过程和氧代酸代谢过程。碱胁迫下，在细胞组分中多数差异蛋白注释的条目为细胞外区和凋亡细胞，在分子功能中多数差异蛋白注释的条目为催化活性、氧化还原酶活性、裂解酶活性和碳氧裂解酶活性，在生物过程中多数差异蛋白注释的条目为脂质生物合成过程、细胞脂质代谢过程、有小分子生物合成过程和脂质代谢过程。图4
2.4 差异蛋白的KEGG注释富集
研究表明，盐胁迫下前10条显著富集的KEGG通路分别为类黄酮生物合成、苯丙类生物合成、核糖体、mRNA监控途径、剪接体、内质网中的蛋白质加工、升糖素信号通路、MAPK信号通路、糖酵解/葡萄糖生成和氨基酸的生物合成。碱胁迫下前10条显著富集的KEGG通路分别为：类黄酮生物合成、苯丙类生物合成、单萜类生物合成、半萜类和三萜类生物合成、萜类主链生物合成、苯丙氨酸代谢、半乳糖代谢、吞噬泡、次级代谢产物的生物合成和代谢途径。图5
2.4.1 碳固定和能量代谢
研究表明，CS根中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、柠檬酸合酶、谷氨酸脱氢酶和谷草转氨酶活性分别显著降低12.0%、9.9%、9.7%、32.8%、3.2%和5.5%，苹果酸脱氢酶活性显著增加25.8%；AS根中己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和谷草转氨酶活性分别显著增加10.9%、5.9%、10.4%、45.1%、26.3%和23.4%。同样在蛋白质组数据中也筛选出相关蛋白，且其变化趋势与酶活性基本相同。图6
在AS处理下，只有半乳糖代谢通路显著富集，其中只检测到A0A7J9L4C2和A0A7J9LKB1显著下调。表3
2.4.2 氨基酸代谢
研究表明，盐胁迫下棉花根中氨基酸代谢途径显著富集。盐胁迫下A0A7J9LUW0、A0A7J9KN24和A0A7J9LXZ1等90个差异蛋白在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等14条氨基酸代谢途径中显著富集，其中14个差异蛋白上调，76个差异蛋白下调。表4
碱胁迫下棉花根中氨基酸代谢途径显著富集。在AS处理下，A0A7J9KVJ8 、A0A7J9LEH2和A0A7J9MGE3等4个差异蛋白在苯丙氨酸代谢和氨基酸的生物合成2条氨基酸代谢途径显著富集，其中1个差异蛋白上调，3个差异蛋白下调。表5
2.4.3 遗传信息处理
研究表明，在翻译过程中共鉴定出68种差异蛋白，其中A0A7J9LIS1和A0A7J9MU38等23种蛋白质上调，而A0A7J9MNJ2和A0A7J9LVI7等其余45种蛋白质均下调；在折叠、分类和降解过程中共鉴定出32种差异蛋白，其中A0A7J9M0U3和A0A7J9MGA2等9种蛋白质上调，而A0A7J9L0I8和A0A7J9N9M4等23种蛋白质均下调；在转录过程中共检测出22种差异蛋白，其中A0A7J9LZS1和A0A7J9M0U3等10种蛋白质上调，A0A7J9MD56和A0A7J9LFV0等12种蛋白质下调；在复制和修复过程中共检测到7种差异蛋白，其中A0A7J9LR85和A0A7J9MR62等4种蛋白质均下调， A0A7J9LVD6和A0A7J9M8P6等3种蛋白质上调。而在碱胁迫处理下的根中未检测到与遗传信息相关的差异蛋白。图7
2.4.4 信号传导
研究表明，CS处理富集了MAPK信号通路和植物激素信号传导等5条信号传导途径，AS根没有信号传导通路富集。在CS处理下， MAPK 信号通路中A0A7J9KZD8和A0A7J9LX47等6个蛋白显著上调，A0A7J9LW53和A0A7J9LCC9等6个蛋白显著下调；植物激素信号传导通路中A0A7J9L9T9和A0A7J9LX96等4个蛋白显著上调，A0A7J9LW53和A0A7J9MPP5等6个蛋白显著下调；AMPK信号通路中A0A7J9NAK5和A0A7J9N9M4等10个蛋白均显著下调；钙信号通路中A0A7J9LX47和A0A7J9LIH2两个蛋白显著上调，A0A7J9M7L8和A0A7J9L4M6等3个蛋白显著下调；cAMP信号通路中A0A7J9LXK4和A0A7J9MF74等4个蛋白显著下调，只有A0A7J9LX47显著上调。表6
3 讨 论
3.1
盐碱胁迫是限制农业生产的主要非生物逆境之一，严重破坏植物生理生化代谢和发育，抑制植物的生长［19-21］。在盐胁迫和碱胁迫下的根系中分别筛选出1 725种和75种差异蛋白，盐胁迫下的差异蛋白数量显著多于碱胁迫，盐胁迫对棉花的影响似乎更大。从亚细胞定位结果来看，盐胁迫下的差异蛋白主要集中于细胞质和细胞核，碱胁迫下的差异蛋白主要集中于分泌蛋白和细胞质。
能量代谢能为作物提供大量的能量用于生长发育和抵御胁迫［22-24］。盐胁迫下，共鉴定出53个与能量代谢相关的差异蛋白（43个下调，10个上调），盐胁迫显著抑制棉花根系的能量代谢。脂肪酸代谢、2-氧代羧酸代谢、氮代谢、甲烷代谢和硫代谢受抑制。碱胁迫下，棉花根系只有半乳糖代谢被显著抑制。己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解过程中的限速酶，上述酶的活性在盐胁迫下显著降低但是在碱胁迫下显著增加，这说明糖酵解过程在盐胁迫下被显著抑制但是在碱胁迫下被显著增强。丙酮酸激酶表达增加促进了草酰乙酸和苹果酸的转化积累，同样有研究显示碱胁迫显著促进丙酮酸激酶的上调［25］。
3.2
氨基酸对于作物的新陈代谢和应激反应至关重要［26］。盐胁迫下，共鉴定出90个与氨基酸代谢相关的差异蛋白（76个下调，14个上调），盐胁迫显著抑制棉花根系的氨基酸代谢。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代谢，色氨酸代谢，精氨酸生物合成，组氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，赖氨酸降解被显著抑制。碱胁迫下苯丙氨酸代谢被显著抑制。盐胁迫下，谷氨酸脱氢酶和谷草转氨酶活性显著降低，碱胁迫下谷氨酸脱氢酶和谷草转氨酶活性显著增加。
3.3
遗传信息的改变是响应和适应盐碱胁迫的关键过程［27］。盐胁迫下，共鉴定出129个与遗传信息处理相关的差异蛋白（84个下调，45个上调），盐胁迫显著抑制棉花根系的遗传信息处理。翻译，转录，折叠、分类和降解，复制和修复均被显著抑制。而在碱胁迫处理下的根中未检测到与遗传信息相关的差异蛋白。
当作物处于胁迫条件下，不同的信号传导途径被激活。盐胁迫下，共鉴定出42个与信号传导相关的差异蛋白（29个下调，13个上调），看盐胁迫显著抑制棉花的信号传导。AMPK信号通路、cAMP信号通路显著抑制，MAPK 信号通路中的差异蛋白数量最多，但是上调和下调的数量相等。AMPK信号通路参与细胞能量传感和稳态控制［27］，盐胁迫下该途径被抑制，可能会导致棉花根系能量稳态失衡。而在碱胁迫处理下的根中未检测到与信号传导相关的差异蛋白。
4 结论
盐胁迫显著抑制棉花根系中脂肪酸代谢、2-氧代羧酸代谢、氮代谢和糖酵解等能量代谢过程，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等氨基酸代谢过程，翻译，转录，折叠、分类和降解，复制和修复等遗传信息处理过程，以及AMPK信号通路、cAMP信号通路等信号通路。碱胁迫抑制了棉花根系的半乳糖代谢和苯丙氨酸代谢但是促进了糖酵解，对遗传信息处理和信号传导无显著影响。
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Effects of different saline and alkaline stress on
the proteome of cotton root system
SUN Caiqin， WU Jia， HUANG Hai， GUO Jiaxin， MIN Wei， GUO Huijuan
（Agricultural College， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832000， China）
Abstract：【Objective】 Exploring the mechanism of cotton tolerance to salt and alkali stress plays an important role in improving cotton yield in Alkali soil in Xinjiang.
【Methods】 This study used cotton as the experimental material， and set up three treatments： control （CK）， salt stress （NaCl， CS）， and alkali stress （NaHCO3+Na2CO3， AS）. Then， TMT technology was used to analyze the changes in protein expression in cotton roots under salt and alkali stress， and bioinformatics analysis was performed on the screened differential proteins.
【Results】" The results showed that under salt stress， the activities of Hexokinase， Phosphofructokinase， Pyruvate kinase and citrate synthase in roots were significantly reduced by 12.0%， 9.9%， 9.7%， and 32.8%， respectively. Under alkali stress， the activities of Hexokinase， Phosphofructokinase， Pyruvate kinase， Malate dehydrogenase， Glutamate dehydrogenase and cereal Transaminase in roots were significantly increased by 10.9%， 5.9%， 10.4%， 45.1%， 26.3%， and 23.4%， respectively. A total of 1725 differentially expressed proteins were screened under salt stress， including 508 upregulated differentially expressed proteins and 1217 downregulated differentially expressed proteins. Among them， there were 10 upregulated differentially expressed proteins and 43 downregulated differentially expressed proteins in energy metabolism， 14 upregulated differentially expressed proteins and 76 downregulated differentially expressed proteins in amino acid metabolism， 45 upregulated differentially expressed proteins and 84 downregulated differentially expressed proteins in genetic information processing， and 13 upregulated differentially expressed proteins and 29 downregulated differentially expressed proteins in signal transduction; Under alkaline stress， there were a total of 75 differentially expressed proteins， including 30 upregulated differentially expressed proteins and 45 downregulated differentially expressed proteins. Among them， there were only 2 downregulated differentially expressed proteins in energy metabolism， 1 upregulated differentially expressed protein in amino acid metabolism， and 3 downregulated differentially expressed proteins. No differentially expressed proteins were identified in genetic information processing and signal transduction.
【Conclusion】 The results indicate that salt stress significantly inhibits energy metabolism， amino acid metabolism， genetic information processing and signal transduction in cotton roots， while alkali stress has no significant effect on genetic information processing and signal transduction.
Key words：salt stress; alkali stress; cotton; proteome; amino acid metabolism; energy metabolism
Fund projects：Project of National Natural Science Foundation of China （32160742）; Open Fund of Key Laboratory of Northwest Oasis Agro-Environment of Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China （XBLZ-20214）; Youth Innovation Talent Cultivation Program of Shihezi University （CXPY202111）; Scientific Research Starting Foundation for High Level Talents of Shihezi University （RCZK202017）
Correspondence author： GUO Huijuan （1989-）， female， from Fugou， Henan， associate professor， doctoral， masters supervisor， research direction： plant stress resistant nutritional physiology and molecular biology， （E-mail） guohjmw@163.com
