摘 要：【目的】分析新疆北疆地区棉花黄萎病的致病力及其分化现状，以昌吉市、沙湾市为主，鉴定两地收集的棉花黄萎病的形态特征及致病力。
【方法】利用棉花落叶型黄萎病的特异性引物DB19f/DB22r和非落叶型引物INTND2f/INTND2r对所有菌株的致病力进行分子鉴定，并进行全基因组重测序，以SNP 位点作为标记进行遗传多样性分析，并利用显微镜观察菌落、菌丝和孢子形态，以强致病力菌种V991作对照，观察菌落形态和致病力鉴定，采用叶绿素荧光成像技术比较观测具有强致病力的Vd-3和V991的病情变化图像和荧光参数变化趋势。
【结果】14个菌株均为落叶型。其菌落为圆形，菌丝的轮枝数为2，孢子形态为长卵圆形。与V991相比，Vd-3的病情指数最高，属强致病力的菌株，其对棉花具有明显不同的侵染方式和速度，Vd-3的侵染从叶缘到叶片中央，而V991的侵染是从叶肉部分的零星发病扩展到叶缘，再发展到中央部分，并且Vd-3侵染叶片各荧光成像和参数天变化趋势更为显著，其中非调节性能量耗散的量子产量Y（NO）和非光化学淬灭NPQ4在第6 d即到变化拐点，最大光化学量子产量Fv/Fm和实际光量子产量Y（Ⅱ）则变化缓慢，13 d 时Fv/Fm表现明显差异。
【结论】昌吉市、沙湾市两地的大丽轮枝菌均为落叶型，圆形菌落，菌丝轮枝数是2，长卵圆形孢子，Vd-3不仅为遗传距离最远且变异性大的菌株，而且为最强致病力的黄萎病病株，与V991相比，对棉花具有不同的侵染方式，荧光参数Y（NO）和NPQ变化更为敏锐。
关键词：致病力；叶绿荧光成像；棉花黄萎病；全基因组重测序
中图分类号：S435.1 ""文献标志码：A
文章编号：1001-4330（2025）01-0174-08
收稿日期（Received）：
2024-07-27
基金项目：
新疆维吾尔自治区重大专项“新疆主要农作物创新育种工程-子课题机采棉新品种培育及技术示范”（2021A02001-4）
作者简介：
赖成霞（1972-），女，新疆乌鲁木齐人，副研究员，研究方向为棉花抗逆分子育种，（E-mail）lchxia2001@163.com
通信作者：
马君（1983-），男，甘肃民勤人，副研究员，研究方向为棉花种质资源收集与利用，（E-mail）xj.majun@163.com
0 引 言
【研究意义】大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）是引起新疆棉花黄萎病的主要因素［1］，可导致棉花落叶、发育迟缓和产量损失及纤维品质的急剧下滑，寄主棉花也相应形成一系列的复杂生理生化机制抵御大丽轮枝菌的侵染［2］，当病原菌侵染植物后，大丽轮枝菌的小孢子和菌丝不仅仅能在棉花的维管系统中定殖、繁衍，与寄主植物发生养分和水分等竞争，还能释放毒素［3］和诱导寄主棉花产生免疫反应［4］等复杂机制来影响棉花的生长发育的，包括修饰寄主角质层组织结构［5-6］、形成抗菌物质［7］、稳定活性氧（ROS）［8］、传导激素信号［9］等。2021年新疆棉花黄萎病的发病面积占总面积的50%以上，重病田达6.67×104 hm2（100万亩）［10］，自2004年起新疆北疆地区棉花黄萎病的发生就呈现逐年激增态势［11-12］，2023年调查北疆棉田土壤发现是以菌核型大丽轮枝菌为主，并且强致病性菌株占调查菌株的94.12%以上［13］。由于新疆北疆棉区土壤生理环境跨度大，差异明显，黄萎病病原菌呈现多样性、变异性特点。致病力分化已成为该病反复猖獗危害的主要原因［14-15］。针对性研究黄萎病的致病分化特性，对棉花的抗病育种及精准防治具有重要意义。【前人研究进展】新疆北疆地区的棉花黄萎病致病力分化现象一直被监测中［11-15］，新疆黄萎病致病力存在强、中、弱3种致病类型，并发现存在落叶型黄萎病，并且中等致病力的黄萎病菌株占比大，北疆大部分棉田病株的黄萎病病原菌的强致病力菌株占比已高达76.5%，并且通过对北疆棉田的土壤中的微菌核进行调查，发现落叶型黄萎病在所调查菌落中占97.6%。【本研究切入点】目前大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病已成为新疆北疆地区棉花安全生产的障碍性因素，培育抗病品种是最经济、有效的策略。因大丽轮枝菌病菌的致病力分化速度快且强，需针对性研究新疆北疆棉花黄萎病致病力分化及为害状态。【拟解决的关键问题】以昌吉市、沙湾市为主，对两地收集的棉花黄萎病的致病特性、形态特征、致病力及侵染方式进行鉴定。针对性研究当前强致病性的大丽轮枝菌与以往大丽轮枝菌的致病分化状态，揭示当前大丽轮枝菌对棉花致病性，为有效选育抗病品种及黄萎病的综合防治提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 病原菌
Vc-1～Vc-4 大丽轮枝菌株来自昌吉市，Vd-1～Vd-10菌株来自沙湾市。对照菌株V991（Verticillium daliae Kleb）来自华中农业大学植物学院朱龙付课题组。
1.1.2 供试药剂及农药
马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基，马铃薯葡萄糖培养基（Potato dextrose，PD）英国Oxoid公司）。100 bp DNA ladder，Golden View，琼脂糖，Tris，冰乙酸等
1.1.3 黄萎病致病力分子鉴定
对获得的各菌落利用PCR技术进行分子鉴定：落叶型引物［16］为DB19f：5′-CGGTGACATAATACTGAGAG-3′，DB22r：5′-GACGATGCGGATTGAACGAA-3′，非落叶型引物［17］为INTND2f： （5′-CTCTTCGTACATGGCCATAGATGTGC-3′），INTND2r： （5′-CAATGACAATGTCCTGGGTGTGCCA-3′）
1.2 方 法
1.2.1 培养基配制
培养棉花黄萎病菌丝的固体培养基是马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar，PDA）培养基，培养基的配制：39 g PDA干粉加入进1 L水中，完全煮沸溶解后，121℃高压灭菌15 min，再倒板；观察孢子形态、大小的是液体查氏（Czapek）培养基：1 L水中含有20 g蔗糖，2 g NaNO3 ，1 g K2HPO4·3H2O ，0.5 g KCl ，0.5 g MgSO4·7H2O ，0.01 g FeSO4·7H2O，121℃高压灭菌15 min。
1.2.2 菌种鉴定的PCR反应体系和扩增条件
菌种鉴定采用加热裂解法，用枪头挑取少量菌丝，到如下PCR管中，并以DB19f和DB22r作为鉴定落叶型黄萎病的引物对，以INTND2f和INTND2r作为鉴定非落叶型黄萎病的引物对，进行如下PCR反应体系和扩增条件：95℃， 预变性5 min；95℃ 变性1 min，54℃ 退火1 min，72℃ 延伸30 s；执行35循环，72℃ 延伸10 min；4℃ 保存。
1.2.3 全基因组测序
收集14份新疆北疆大丽轮枝菌，沙湾市的菌系被命名为Vd1～10，昌吉市的被命名为Vc1～4，菌样送至北京百迈克生物科技有限公司进行文库制备与高通量测序。利用Bwa-mem2（v2.2）软件将测序后的数据比对到参考基因组上，比对结果采用samtools flagstat/depth等命令计算比对效率、测序深度及覆盖度等信息。采用 GATK软件工具包实现对 SNP/InDel 检测，使用samtools（v1.9）过滤冗余，并使用百迈客云平台对 SNP 的深度为10的数据进行遗传多样性分析，采用邻位相接法构建系统发育树（Bootstrap method 1 000 次）。
1.2.4 棉花黄萎病在离体叶片的致病力鉴定
离体叶片致病力鉴定依据赖成霞［13］等研究鉴定，选择大小一致的新陆早57号棉花花期倒三叶的叶片，剪下叶片后用吸满水分的棉絮放在叶柄处保湿，并进行消毒处理，即70%乙醇中处理30 s，再用灭菌去离子水冲洗2次，用滤纸吸干叶片表面的水滴后，用无菌剪刀将叶柄剪去1 cm，然后插入含有1.5 mL菌液的离心管侵染40 min。每个菌系进行6个重复，侵染结束拿出叶片用滤纸吸干表面菌液，插入带有1.5 mL灭菌水的离心管，放入25℃温室中弱光培养，培养13 d 。
采用热裂解法，利用落叶型引物DB19f/DB22和非落叶型引物INTND2f/INTND2r对从从采自昌吉市的4株棉花黄萎菌（Vc-1、Vc-2、Vc-3、Vc-4） 和沙湾市的 10 株棉花黄萎病菌（ Vd-1～Vd-10 ） 及落叶型标准菌株 V991进行致病力分子鉴定。
1.2.5 棉花黄萎病大丽轮枝菌菌落形态和显微观察
生长在PDA培养基上15 d的孢子和菌丝用水洗脱下进行显微观察，统计孢子的形状和大小；盖玻片斜插至菌饼前方，待菌丝生长至盖玻片上，显微观察菌丝形态。
1.2.6 叶绿素荧光成像系统对棉花黄萎病病原菌侵染叶片成像过程的采集
利用叶绿素荧光成像系统采集棉花黄萎病原菌侵染离体叶片，棉花叶片暗处理30 min后，设定5～6个兴趣点AOI后，在软件的Kinetics窗口执行的动力学变化曲线检测，结果从Report窗口导出。选用Fv/Fm（光系统II最大光量子产量）、Y（Ⅱ）（光系统II实际光量子产量）、NPQ（非光化学淬灭）、Y（NO）（非调节性能量耗散的量子产量）等叶绿素荧光参数作为对病害侵染的叶绿素荧光参数。
1.2.7 病情指数
采用全面调查法，统计棉花黄萎病叶片发病情况，计算病情指数，分级标准：叶片无病斑，0级；病斑占整个叶面积的5%以下，1级；病斑占整个叶面积的6%～11%，3级；病斑占整个叶面积的11%～20%，5级；病斑占整个叶面积的21%～50%，7级；病斑占整个叶面积的51%以上，9级；死亡，11级。
病情指数=∑（极值×株数）最高极值×总株数100%。
1.3 数据处理
试验数据采用Microsoft Excel进行数据整理，利用Origin2018 软件和Sigmaplot14.0对数据进行分析作图，图片利用Photoshop 2017进行处理。
2 结果与分析
2.1 棉花黄萎病致病力分子鉴定
研究表明，利用DB19f/DB22引物对均可从15个菌落中扩增出500 bp目的条带，而INTND2f/INTND2r对则无任何产物被扩增出，14个大丽轮枝菌株和V991一样均为落叶型。图1
2.2 遗传多样性
研究表明，当遗传距离大于 0.001 时，14 份大丽轮枝菌株被聚为 4 类，类群I有2个菌株，包括Vd-5和Vd-9，类群II有1个菌株，Vd-3，类群III有8个菌株，包括Vd-1、Vd-2、Vd-4、Vd-6、Vd-8和Vd-10，类群IV有3个菌株，包括Vd-4，Vd-7和Vc2，其中，类群I和类群II，类群III和类群IV的相似度比较高，结合 14 份菌株的来源，沙湾市和昌吉市两地的大丽轮枝菌遗传背景比较接近，仅有少数遗传距离稍远，且变异性大的菌株Vd-3分布在沙湾市。图2
2.3 菌落形态及显微观察
研究表明，15株大丽轮枝菌的菌落形态为圆型，孢子为长卵圆形，各菌落菌丝均含有2个。表1，图3
2.4 致病力鉴定
研究表明，所调查的15个菌株侵染棉花叶片10 d后，其致病力表现明显不同，病情指数在35以下的菌株有3株，分别为Vd-1、Vd-4、Vd-7；病情指数在35～60之间的菌株有8株，分别为Vc-2、Vc-3、Vc-4、Vd-2、Vd-6、Vd-8、Vd-9和Vd-10；病情指数在60-70的菌株有2株，分别为Vc-1和Vd-5，病情指数在70以上的菌株有2株，分别为V991和Vd-3。其致病力大小的顺序为Vd-3gt;V991gt;Vc-1=Vd-5gt;Vc-2gt;Vd-8=Vd-9=Vd-10gt;Vc-3gt;Vd-10gt;Vd-2gt;Vc-4gt;Vd-4=Vd-7。图4
2.5 接种典型菌株后的棉株叶片外观及叶绿荧光成像变化特征
研究表明，2个菌侵染10 d时才出现病症，而叶绿素荧光参数YII、NPQ4则在第6 d就有变化，其中Vd-3的Y（II）、NPQ4显示病症的发展是由叶缘至叶片中央蔓延，随着侵染天数的增加，到第13 d，NPQ4、YII荧光参数显示的发病面积分别占整个叶片面积的90%和80%以上，而V991的Y（II）、NPQ4病症蔓延的方向为先叶肉零星分布，再叶缘，最后由叶缘向叶片中央蔓延，并且到第13 d，NPQ4、YII荧光参数显示的发病面积分别占整个叶片面积的85%和50%以上，V991与Vd-3发病程度、感染方式具有差异性。荧光参数NPQ4和Y（NO）更能敏锐地反应病原菌的侵染状态。图5
2.6 典型菌株侵染后的叶绿素荧光参数动力学曲线变化
研究表明，随着侵染时间的增加，Vd-3和V991侵染引发的叶片各荧光参数均有明显变化，其中Vd-3的叶绿素荧光参数NPQ4和Y（NO）到达拐点的时间为6 d，而V991 2个参数到达拐点的时间则为10 d，Vd-3比V991对植物的侵染更为严重。并且随着侵染时间的增加，Fv/Fm、Y（II）、NPQ4均随时间延长而下降，Vd-3的Fv/Fm数值在第12～13 d时大幅度下降，发病情况非常严重。V991则较为缓慢，发病也趋于平缓。侵染Vd-3的叶片发病程度比V991高，Fv/Fm曲线是判定叶片发病严重与否的一个重要标志。Y（II）中荧光值V991一直在Vd-3的曲线上方，2者荧光参数变化不大，且下降规律相同。根据叶绿荧光成像显示，叶片也在同一时间发生症状，两者互相印证。两者NPQ4的数值总体先上升后下降，NPQ4数值下降至接近0，大丽轮枝菌对棉花叶片的侵染逐渐增大。叶绿素荧光成像动力学曲线能够清晰反应植物受病害胁迫程度，与V991相比，Vd-3的荧光参数Y（NO）和NPQ变化更为敏锐感知病原菌入侵的状态。图6
3 讨 论
3.1
精准分析新疆北疆黄萎病菌的致病力分化特点，可有效实现针对性的抗病品种选育及防治药剂筛选［18］，
昌吉市和沙湾市是新疆北疆棉花的重要种植区，以V991为对照，对来自两地共14个菌落从菌落形态、致病力、侵染方式等维度去解析其致病机制。首先，利用PCR技术从分子水平上鉴定了14个菌均为落叶型黄萎病，通过观察北疆地区落叶型棉花黄萎病菌的菌落形态与已报道的落叶型菌落形态存在明显差异，尤其明显的是不具有菌丝团的特征。基因组重测序分析显示Vd-3为遗传距离最远，变异最大的菌株，并且离体叶片致病力鉴定也表明致病力最强的病原菌是Vd-3，而V991是自1995年开始一直被认为是发病最重的落叶型棉花黄萎病菌，而目前发现沙湾市菌系Vd-3发病情况与V991的明显不同，尽管两者病指均处于高位，但Vd-3发病表现更快，其发病部位首先由叶尖、叶缘开始而后迅速发展乃至焦枯死亡。并且叶绿素荧光成像和荧光值变化也表明，其发病最严重且迅猛。
3.2
棉花早预防、早治疗是防治棉花黄萎病的有效方式，基于植物叶绿素荧光技术的无损检测方式和其准确性、效率性的特点，目前其也已成为植物抗病育种［19-20］和病害监测［21-22］的一种有效辅助手段。在研究中各叶绿素荧光参数在13 d的变化趋势中，Vd-3与V991相比，Vd-3的叶绿素荧光参数NPQ4和Y（NO）到达拐点的时间为6 d，而V991的2个参数到达拐点的时间则为10 d ，说明NPQ4和Y（NO）2个荧光参数更能敏锐感知棉花入侵过程，可作为该菌侵染的快速检测指标。
4 结 论
昌吉市、沙湾市两地的大丽轮枝菌均为落叶型，其菌落类型为菌核型和孢子型，Vd-3是为害程度最大，发病速度最快的黄萎病菌，与V991相比，具有不同的侵染方式，Vd-3的侵染从叶缘到叶片中央，而V991的侵染是从中央叶肉部分的零星发病扩展到叶缘，再发展到叶片中央部分，并且荧光参数NPQ4和Y（NO）更能敏锐地反应Vd-3的侵染。
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Pathogen colonys morphological characteristics and
pathogenicity identification of defioating cotton Verticillium
wilt in some areas in northern Xinjiang
LAI Chengxia1， YANG Yanlong1，WANG Penglong1， ZHU Mengyu2，
YANG Dong3， LI Chunping1，GE Fengwei4， Mayila Yusuyin1，
YANG Ni1，MA Jun1
（1. Research Institute of Economic Crops， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China; 2. College of Agriculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830091， China; 3. Plant Protection Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830049， China; 4.College of Life Sciences， Xinjiang Normal University， Urumqi 830054， China）
Abstract：【Objective】 To identify morphological characteristics and pathogenicity of cotton Verticillium wilt collected from Changji and Shawan in the hope of comprehending the pathogenicity and differentiation of the cotton disease in northern Xinjiang.
【Methods】" The molecular detections of the pathogenicity for cotton wilt disease were performed using specific primers DB19f/DB22r for defioating pathotype and INTND2f/INTND2r for nondefioating pathotype. Whole genome resequencing was performed using SNP loci as markers for genetic diversity analysis. The colony morphology and the pathogenicity were identified adopting the virulence strain V991 as the control， chlorophyll fluorescence imaging technology was employed to compare and observe the disease changes and the trend of fluorescence parameters of Vd-3 and V991.
【Results】 Molecular identification showed that all 14 strains examined were defioating pathotype. In comparison with V991 strain， Vd-3 exhibited the highest disease index and high pathogenicity with different infection modes and rapid infection rates; The infection of Vd-3 was seen that the disease symptom extended from the leaf margin to the center， while the that of V991 spread from the sporadic distribution of the mesophyll to the leaf margin and then to the central part by observing the dynamic changes of imaging and fluorescence parameters employing the chlorophyll fluorescence imaging system. The daily variation trend of fluorescence imaging and parameters infected by Vd-3 plants was more obvious; The quantum yield Y （NO） of non-regulatory energy dissipation and the non-photochemical quenching （NPQ） reached the inflection point on the 6th day. The maximum photochemical quantum yield （Fv/Fm） and the actual optical quantum yield Y （Ⅱ） changed slowly， and the Fv/Fm showed obvious difference at 13 d.
【Conclusion】 The strains from Changji and Shawan city are defioating pathotype， and the colony is circular with 2 hyphal branches and long oval spores. In addition to the greatest genetic distance and variability， the most virulent strain of Verticillium wilt disease is Vd-3. Compared with that of V991，Vd-3 possesses the varied the infection mode for cotton， and fluorescence parameters Y （NO） and NPQ can exquisitely perceive the changes.
Key words：pathogenicity; chlorophyll fluorescence imaging; cotton Verticillium wilt; whole genome resequencing
Fund projects：Major Scientific R amp; D Program Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region “Cultivation and Technology Demonstration of New Varieties of Machine-Picked Cotton”（2021A02001-4）
Correspondence author： MA Jun（1983-），male，from Minqin， Gansu，associate research fellow，research direction：cotton germplasm resources collection and vtilization，（E-mail）xj.majun@163.com
